人参皂苷rh2通过激活p38诱导k562细胞自噬凋亡的实验研究

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1、人参皂苷Rh2通过激活p38诱导K562细胞自噬凋亡的实验研究［摘要］为了研究人参皂苷Rh2对人0血病细胞K562的凋亡作用，并从白噬角度来探讨其机制。实验采用CCK8方法检测人参皂苷单体Rh2对人白血病K562细胞增殖抑制作用；流式细胞术检测细胞凋亡；Hocchcst染色观察细胞核染色质的形态；吖啶橙和MDC染色观察Rh2对细胞自噬的影响；Westernblot和RTPCR检测Rh2对白血病细胞自噬重要基因的表达的影响；运用自噬抑制剂(3MA)研究自噬对细胞增殖和凋亡的影响。CCK8显示人参皂苷Rh2在低浓度时能有效抑制白血病细胞増殖，且其抑制作用具有浓度和时间依赖

2、性；FCM和Hocchcst显示Rh2能增加细胞的凋亡和染色质呈凋亡形态改变;吖啶橙和MDC染色发现Rh2组细胞的绿色荧光增强，并出现大量酸性自噬小泡；Westernblot和RTPCR结果发现Rh2能上调Beclinl,LC3A,LC3B,激活型Caspase3和pp38的表?」运用细胞自噬剂(3MA)会削弱Rh2对K562的增殖抑制和促凋亡作用。人参皂苷Rh2可能通过激活磷酸化的p38,诱导细胞自噬途径，从而抑制K562细胞增殖和促进凋亡作用。［关键词］人参皂苷Rh2;0血病；自噬；凋亡白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，是国A十大高发恶性肿瘤之一。迄

3、今，白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗,但此疗法副作用甚大，复发率很高，尤其对机体免疫与造血系统有极人的损害。因此，可以从传统的中药中寻找天然低毒的药物来治疗白血病。其中人参PanaxginsengCAMeyer是我国传统中草药，在肿瘤的治疗方面具有很高的药用价值［1］。S型人参皂苷单体Rh2［（S）Rh2］是人参中天然活性成分之一，是一种从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合物，其毒性低，相对分子质量小，脂溶性好，具有很强的抗肿瘤活性［2］。目前大家认为，细胞死亡包括3种类型：即坏死、凋亡和自噬性细胞死亡，其中，自噬是属于比较热门的II型细胞程序性

4、死亡方式［3］。细胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更为主动和重要的角色。自噬在肿瘤细胞起到双刃剑作用，可以保护肿瘤细胞，也可以杀伤肿瘤细胞［4］。作者选取人红白血病K562细胞株作为研宂对象，为了进一步弄清楚人参皂苷Rh2对白血病的药理作用，并从自噬途径研究人参皂苷Rh2促进人白血病细胞自噬凋亡机制，为Rh2应用于临床治疗0血病奠定实验和理论基础。1材料11K562细胞株人红白血病K562细胞株购自上海ATCC细胞库。每次取对数生长期的K562细胞以5X108个/L接种于10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37°C,5%C02饱和湿度下培养，每2〜3d传代或

5、换液。12药品Rh2购自成都曼斯特科技有限公司（纯度98%），取200uLDMS0加入20mgRh2使之充分溶解，配制成100mg?L_l原液，-20QC冷冻保存。实验前用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液稀释成所需浓度。13试剂胎牛血清，RPMI1640培养基（美国Hyclone公司）；CCK8试剂盒（日本同仁化学研宄所）；AnnexinVPI双标凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制剂（美国Sigma公司）;MAPK通路抗体试剂盒，Bcclinl,LC3A/B多克隆抗体（美国CellSignalingTechnology）

6、；Bcl2,Bax多克隆抗体（美国Epitomics公司）。14仪器超净工作台（Sanyo）;倒置显微镜、倒置荧光显微镜（Olympus）;低温离心机（Sigma）；酶标仪，垂直电泳仪，电转仪，ChemiDocXRS化学发光成像系统，PCR仪（BioRad）；二氧化碳培养箱（Thermo）。2方法21CCK8法培养对数生长期的K562细胞，以1X104个/孔接种于96孔板中。分为空白对照组、药物组和本底对照组，每组设6个复孔，每孔200uL,（S）Rh220〜100ymol?L-l；本底对照组：只加RPMI1640培养液。培养24，48，72h后，每孔加入10ULCC

7、K8检测液，轻轻摇匀，孵育25h后，用酶标仪（波长450nm）检测每孔吸光度（A）,并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（TC50）。22FCM检测早期凋亡培养对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度分别至5X108个/L,接种于6孔细胞培养板中。实验分为4组：I组为空白对照组，正常培养;II组加入（S）Rh260umol?L-l;III组加入5mmol?L-l的自噬抑制剂3MA;IV组同时加入（S）Rh260ymol?L-1和3MA5mmol?L-1。每孔3mL培养液，在37°C，5%C02饱和湿度下培养24,48h后，分别收集各组细胞，用预冷001m