临床医学毕业论文百草枯及其与代森锰、鱼藤酮联合暴露对小鼠黑质纹状体多巴胺能系统的影响

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1、百草枯及其与代森锰、鱼藤酮联合暴露对小鼠黑质纹状体多巴胺能系统的影响姓名：2014年6月25日百草枯及其与代森锰、鱼藤酮联合暴露对小鼠黑质纹状体多巴胺能系统的影响【摘要】目的探讨百草枯(PQ)及PQ与代森锰(MB)、鱼藤酮(R)对小鼠的联合暴露与帕金森病(PD)病因的关系。方法将48只健康清洁级5周龄昆明种小鼠随机分为生理盐水组(Saline组)、助溶对照组(Z组)、PQ(5mg/kg)组、PQ(5mg/kg)+MB(15mg/kg)组、PQ(5mg/kg)+R(0.8mg/kg)组、PQ(5mg/kg)+MB(

2、15mg/kg)+R(0.8mg/kg)组，每组8只。采用腹腔注射方式进行染毒，染毒剂量为10ml/kg,每周染毒2次，连续染毒6w。采用爬杆试验和开阔试验检测小鼠运动行为的变化;对SNc区域进行组织病理学观察和神经元细胞计数;荧光分光光度法检测纹状体(Caudateputamen，CPu)脑区屮DA的含量。结果单独PQ暴露的小鼠没有引起黑质纹状体(SNCPu)通路的病理性改变;而PQ与MB或R的联合暴露仅导致SNc区域的病理变化，没有引起CPu中DA含量和行为学上的改变;PQ、MB及R三者的联合暴露可引起SNC

3、Pu通路的改变(P0.05),但是没有导致小鼠产生临床上类PD症状。结论成年小鼠低剂量亚慢性的PQ暴露不会引起SNCPu通路的损伤，而和其他环境毒物共同作用卜*会对SNCPu的DA能系统产生一定的影响。【关键词】百草枯;帕金森症;多巴胺;黑质纹状体帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)病因至今尚不清楚，普遍认为是基因风险因素、环境暴露和年龄三者共同作用引起的一种神经系统退行性疾病〔1)。环境因素与PD的发病可能存在着一定的联系，但究竞何种农药可致PD目前尚不能肯定，对它们进行筛选也是十分困难。百草

4、枯(praquat，PQ)是一种曾广泛应用于农业生产、结构为二氢毗啶类的除草剂，对于PQ能否引起黑质纹状体(SNCPu)通路的损伤问题存在争议(2,3)。PQ与系真菌剂代森锰(maneb,MB)和杀虫剂鱼藤酮(rotenone,R)在使用区域上存在广泛的重叠，而以往对PQ和MB联合暴露的动物试验结果并不十分一致〔4,5)，而对于PQ与R的联合暴露则少有报道。本研究基于当前对PQ的争议以及PQ与其他儿种神经毒素联合作用对SNCPu系统的影响进行研宄，探讨哪些农药与PD直接相关。1材料与方法1.1动物清洁级5w龄昆明

5、种小鼠48只〔中科院动物试验中心，许可证号：SCKK（沪）20070005）,雌雄各半，安静环境饲养，自由取食饮水，人工昼夜节律（12〜12h），饲养3w后开始暴露。将动物随机分为生理盐水组（Saline组）、助溶对照组（Z组）、PQ组、PQ+MB组、PQ+R组及PQ+MB+R组，每组8只。1.2方法1.2.1试剂与仪器PQ（纯度为98%,上海晶纯试剂有限公司），MB和DA标准品（纯度分别为90.3%和99%,美国Sigma公司），其余试剂均为国产分析纯。F4500型荧光分光光度仪（円本円立株式会社），XW80a

6、型漩涡混合器（上海医科大学仪器厂），RJTGL16GA型台式高速冷冻离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）。YD1508R型轮转式切片机（浙江金华市益迪医疗设备厂）。1.2.2模型制备将PQ（0.5g/L）和MB（1.5g/L）分别溶于生理盐水中，R（0.08g/L）溶解于二甲亚砜：10%聚乙二醇（1:1）的混合溶剂，含R的暴露组于每周一、四下午3时0.8mg/kg腹腔注射R,Z组注射等量的助熔剂（二甲亚砜：10%聚乙二醇）;所有暴露组每周二、五卜午3时PQ5mg/kg和MB15mg/kg进行腹腔注射，染毒剂量为1

7、0ml/kg,Saline组和Z组注射等量的生理盐水，所奋组别全部暴露6w。每周日上午9时称量小鼠体重。在末次染毒后的第2天进行行为学检测。1.2.3爬杆试验自制直径为1cm，高60cm的直木杆，杆顶部有一橡胶球,木杆固定于木制底座上。将小鼠头向卜放置，后爪抓住橡胶球，记录动物从开始向下爬到前爪着地所用的吋间，如遇小鼠中途停顿或转身向上爬，则重新检测，每只在记录前训练3次，训练完毕后对其进行爬杆时间测定3次。1.2.4自主活动计数自制木箱，底部面积为64cmx64cm底部刻出8cmx8cm的格子。在安静、光线较暗

8、的环境中检测。小鼠适应环境10min后计数5min内小鼠移动的格子数，反映小鼠的运动活性。1.2.5小鼠SNc区域HE染色用1%的戊巴比妥钠0.5ml麻醉动物后开胸，先用4"C生理盐水快速冲洗血迹，然后用4°C的4%的中性甲醛先快后慢的灌流固定15min后断头取脑，分出屮脑部分置于同样的固定液屮3d，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。做SNc区段连续冠状切片，片厚6，