srap-rapd实验操作流程

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1、SRAP-RAPD1酶类及试剂TaqDNA聚合酶为大连宝生物工程公司产品；蛋白酶K为Merk公司产品；T4DNA连接酶为Promega公司产品。WizardDNAClean-upSystem、Wizard1MPCRPrepsDNAPurificationSystem为Promega公司产品；小量基因组DNA抽提试剂盒、UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒为上海生物工程公司产品。DL-2000DNASizemarker为大连宝生物工程公司产品，lOObpDNASizemarker由广州普博馈赠。

2、2培养基LB液体培养基：胰蛋0胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加800mL去离子水充分溶解，用lmol/L的氢氧化钠溶液调整pH为7.2〜7.4,加去离子水定容至lOOOmL，分装后15磅高压蒸汽火菌15〜20min,4°C保存备用。LB固体培养基：于LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌15〜20min,待其冷却至70°C左右时倒板，凝固后4°C保存备用。LB选择培养基：在LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌15〜20min，待其冷却至5（TC左右时，

3、加入氨苄青霉素（Amp）（终浓度1000IU/mL）轻轻摇动使其混合均匀，迅速分装至无菌平皿，室温凝固后4°C保存备用。3缓冲液及其它溶液按分子克隆实验指南（第三版）（萨姆布鲁克等，2002）介绍的方法进行。（1）Tris-Cl（pH8.0）Tris碱121.lg浓盐酸42mL加去离子水定容至1000mL(2)TE缓冲液(pH8.0)lOmol/LTris-Cl(pH8.O)0.5MEDTA(pH8.O)加无菌去离子水定容至100ml,混匀(3)5xTBE缓冲液Tris硼酸EDTA加去离子水定容

4、至1000mL(4)lOxTBE缓冲液Tris硼酸EDTA(0.25mol/L)加去离子水定容至500mL(5)X-gal液(20mg/mL)X-gal二甲基甲酰胺lgL0.2(iL分装后经高压灭菌，4°C保存。54g27.5g3.72g54g27.5g80)iL0.08g4mL充分溶解混匀，分装于1.5mL灭菌消毒的Eppendorf管中，用锡箔纸裹以避光，-20°C保存。(6)IPTG液IPTG0.6g去离子水3mL充分溶解混匀，用0.25(im孔径的细菌滤器过滤，分装于1.5mL灭菌消毒的

5、Eppendorf管中，-20°C保存。(7)SDS裂解液500mMNaCl70gL100mMTris-Cl(pH8.0)30gL50mMEDTA(pH8.0)150^iL10%SDS30pL(6)70%乙醇无水乙醇火菌双蒸水(9)封底用1%琼脂糖琼脂糖去离子水(10)40%丙烯酰胺液丙烯酰胺Bis去离子水装于棕色瓶中，4"C保存。(11)10%AMP过硫酸铵去离子水(12)0.1%银染液硝酸银去离子水装于棕色瓶中，室温保存。(13)显影液NaOH硼酸甲醛加去离子水定容至1000ml(14)Ca

6、Cl2溶液(0.1mol/L)无水CaCl2灭菌三蒸水充分溶解混匀，定容至250mL,其它试剂30ml70mllg100ml38g2g100mllg10ml0.5g500ml15g0.190g4ml2.77g200mL分装后高压灭菌。Tris碱、EDTA、IPTG、X-gal及SDS为Promega公司产品;胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉均为OXOID公司产品；琼脂糖为上海Yito有限公司产品；溴化乙锭(E.B)、氨苄青霉素(Amp)、TEMED为Sigma公司产品；1OXPCRbuffer、M

7、gCh(25mM)、dNTPs(2.5mMofeach)、2xRapidLigationBuffer、lOxLoadingBuffer、lOxBuffer(H)为大连宝生物工程公司产品；T4kinasebuffer为Promega公司产品；其他化学试剂如NaOH、NaCkBis,硝酸银、丙烯酰胺、硼酸、过硫酸胺、尿素、甲醛等均为国产分析纯级产品。4仪器设备HH-W600数显三用恒温水箱：广州市深华生物技术有限公司产品；电热恒温隔水式培养箱：黄石市恒丰医疗器械有限公司产品；QL-901旋涡混合器：

8、江苏海门市麒麟医用仪器厂产品；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂产品；电子天平(JJ3OO,300g/10mg)：广州市深华生物技术有限公司产品；立式蒸汽灭菌器LS-C35L型：江阴滨江医疗设备厂；真空干胶仪：美国Bio-Rad公司产品；全封闭紫外透射仪(WFH-201-B):广州深华生物技术有限公司产品；超净工作台(SW-CJ-IFD)：苏净集闭安泰空气技术有限公司产品；凝胶图象分析系统：英国UVITEC公司产品；恒压恒流DF-Dn型电泳仪：北京东方特力科贸中心产品；BIO-RAD电