WB实验操作流程

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1、WesternBlot实验操作指南WesternBlot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的特定蛋白进行显影。通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。实验流程主要包括以下几个步骤：样品制备；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。实验器材操作步骤样品制备准备进行westernblot的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。样品为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞

2、、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性对其进行提取。根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。（1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时

3、才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。（2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取：1.将100mg组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS洗涤两次后，4℃，700×g（3000rpm)离心3min

4、，弃上清。20mg组织加入100μl裂解液，置玻璃匀浆器冰上均质30～50次。(如使用组织匀浆机，则按照20mg组织加入100μl裂解液的比例加入裂解液。每个试管加入2个直径2mm的磁珠。将试管放入组织匀浆机中，60HZ，300s。充分裂解后，10000g离心5min，取上清。)2.最大速度涡旋震荡10sec，冰上放置20min，期间取出震荡3-5次,再于4℃，12000rpm离心10min，以沉淀组织或细胞碎片，取上清。生工相关产品：产品编号产品名称产品编号产品名称C500005、细胞核蛋白/浆蛋C510006、C510001RIPA裂解液I~I

5、V白抽提试剂盒C500007、C500008膜蛋白、核蛋白和动物全蛋白提取试C510002胞质蛋白抽提试剂C510003剂盒盒膜蛋白和胞质蛋白石蜡包埋组织蛋白C510005C500058提取试剂盒提取试剂盒细胞核蛋白质提取C500009C500049膜蛋白提取试剂盒试剂盒胞质和线粒体蛋白亚细胞结构蛋白提C500051C500073质提取试剂盒取试剂盒植物蛋白提取试剂一步法昆虫细胞活C500053C510020盒性蛋白提取试剂盒一步法植物活性蛋一步法细菌活性蛋C510004C500023白质提取试剂盒白提取试剂盒一步法动物组织活一步法酵母活性蛋C50

6、0006C500026性蛋白提取试剂盒白提取试剂盒一步法动物细胞活C500022性蛋白提取试剂盒蛋白定量蛋白定量是做WB实验的基础。蛋白定量的目的是：保证同一组中的不同样本的蛋白总量保持一致，只有这样，wb结果的内参、灰度等数据才可信。否则实验数据没有参考价值。蛋白定量的方法很多，常用的有Lowry法、BCA法、紫外吸收法、Biuret法、这些方法各有优缺点。应该按照具体实验选择不同的实验方法进行蛋白定量。示例：BCA法蛋白定量1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温2

7、4小时内稳定。2.完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。3.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20ul。4.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液至20ul。5.各孔加入200ulBCA工作液，37℃放置30分钟。注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深

8、。并且显影反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。6.测定A562，540-595nm之