WB实验步骤

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1、提取细胞或组织蛋白、测定大致含量↓制备SDS-PAGE胶↓蛋白样品变性、电泳↓电泳转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓HRP标记的二抗BST洗涤↓ECL试剂作用↓X-光片曝光、显影↓结果分析[主要试剂]1、SDS-PAGE试剂：2、匀浆缓冲液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：Na

2、Cl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0μl。7、兔抗猪R蛋白抗体、HRP标记羊抗兔IgG（二抗）。[操作步骤]1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀

3、浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜

4、条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。4、免疫反应：（1）用0.01MPBS洗膜，5min×3次。（2）加入包被液，平稳摇动，室温2hr。（3）弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。（5）弃一抗和1%BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。（6）加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01MP

5、BS稀释），平稳摇动，室温2hr。（7）弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。（8）加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。[注意事项]1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。技术服务流程：1.蛋白质抽提o实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。o实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细

6、胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。2.蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE):将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。4.蛋白质转移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。5.westernblot膜的封闭和抗体孵育膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵

7、育1小时以封闭膜上的非特异结合。封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。6.westernblot结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。7.westernblot数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。8.提供实验报告，包

8、括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关数据。westernblot费用：每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品。每张膜的费用是：1500.00元。一抗另计，其它试剂免费，一抗订购时间约为3周。WesternBlot相关试剂产品名称包装单价(RMB)Trypsin-EDTA0.25%,100ml150.00蛋白裂解液（蛋白提取液）10ml60.00