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1、实验基本步骤提取细胞蛋白↓BCA定量↓制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）↓蛋白样品变性↓电泳↓转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓二抗↓TBST洗涤↓显影↓结果分析试剂配制1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L磷酸二氢钾0.24g磷酸氢二钠1.44g氯化钠8g氯化钾0.2g加入500ml纯水，调PH=7.2定容至1L,高压蒸汽灭菌2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）500mlPBS+0.25ml吐温-203.电转液500mlTris1.5g甘氨酸7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷4.电泳液（1X）10x稀释，50
2、ml10x电泳液+450ml纯水5.TBS6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-207.封闭液TBST1X+5%奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热WB实验一、蛋白样品制备准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4℃预冷1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2.加入1ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃，800
3、0r离心5min，然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。3.按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5.裂解完后，于4℃下12000rpm离心5min。7.将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于－20℃保存。二、蛋白含量的测定（BCA定量）准备：96孔板，移液枪（1000ul，10ul，200ul），BCA工作液（A+B），
4、50mlEP管，1xPBS，BSA标准液1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶
5、液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ulPBS溶液5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2>0.98才有用,酶
6、标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存）9.计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10倍）蛋白质定量标准曲线加样量序号12345678标准蛋白量/ul（0.5mg/ml）01248121620背景液（PBS）/ul2019181612840标准液浓度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、SDS－PAGE电泳 1. 配胶（12%,可以提前配好）准备：玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4℃冰箱冷藏）（1）玻璃板验漏5min（2）按表配置分离胶（3）灌胶，加酒精封压，凝30min（注意不要有气
7、泡）（4）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min（5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用2.样品处理准备：PBS，移液枪，1.5mlEP管（1）稀释样品：一般每孔上样5ul，即1mg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至1mg/ml（注意loadingbuffer的加入也得算入）（2）取出上样样品15ul至1.5ml离心管中，加入6×SDS上样缓冲液3ul至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品。
8、）（3）将样品在100℃煮5min震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）3. 电泳准备：电泳液500ml（现配），蛋白胶，10ul移液枪（枪头），样品，Marker，冰盒，电泳装置（1）将SDS-PAGE胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板面向内
