yb―1在低氧微环境诱导的宫颈癌emt中的作用及机制研究

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1、YB-1在低氧微环境诱导的宫颈癌EMT中的作用及机制研究摘要：目的探讨Y-盒结合蛋白-1(Y-boxbindingprotein-1，YB-1)在低氧诱导的宫颈癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)发生中的作用及可能机制，为研宄宫颈癌浸润转移机制提供理论依据。方法应用二氯化钴(CoC12)处理宫颈癌Hela细胞模拟细胞低氧微环境，MTT法检测细胞的增殖活力，筛选CoC12最适作用浓度及时间；倒置显微镜观察低氧6h后细胞形态特征；细胞免疫荧光法检测低氧6h后细胞屮

2、YB-1、Vimentin和酮P-2的蛋白表达及其相互关系。结果模拟低氧微环境的CoC12最适作用浓度为150Pmol/L,最适作用时间为6h(P<0.05)；低氧使Hela细胞逐渐获得了间质细胞的形态特征；低氧6h后，Hela细胞中YB-1、Vimentin、MMP-2表达较常氧组显著增高(P<0.05),且YB-1、Vimentin、MMP-2之间相互呈正相关(P〈0.05)。结论YB-1可能通过YB-1-醒P-2-Vimentin途径，上调Vimentin表达从而在低氧诱导的宫颈癌EMT发生中起到关键作用。

3、关键词：Y-盒结合蛋白-1;上皮间质转化；宫颈癌；低氧微环境中图分类号：R737.33文献标识码：A宫颈癌是涉及多因素、多基因共同作用的妇科常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居女性肿瘤第二位［1］。尽管宫颈癌筛查不断普及，但仍有人量未经筛查的中晚期患者因肿瘤的浸润、转移及对放化疗耐药，从而导致患者不良预后或死亡。近年研宄表明，EMT是具有极性的上皮细胞转变成具有活动能力的间质细胞的过程，是多种肿瘤侵袭转移的里要环节［2］。目前体内、外实验均己证实，EMT在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌等多种肿瘤的浸润和转移

4、中起着重要的作用［3］。因此，研究EMT与宫颈癌的关系及其调控机制，对寻找治疗宫颈癌浸润及转移的冃标靶点有着重要的意义。1资料与方法1.1细胞株和主要试剂宫颈癌Hela细胞由昆明医科大学云南省药理重点实验室周轶平老师馈赠。CoC12购自广州金华大化学试剂有限公司；DMSO、DAPK兔抗人YB-1多克隆抗体购白碧云天生物技术研究所；单克隆小鼠抗人Vimentin、兔抗人丽P_2单究隆抗体购自武汉博士德生物公司；山羊抗兔-TRTTC、山羊抗小鼠-FTTC购自康为世纪。1.2细胞培养Hela细胞置于5%C02、饱和湿度

5、、37°C恒温培养箱闪培养，取对数生长期的细胞进行实验。1.3MTT法检测CoC12对Hela细胞活力的影响1.3.1MTT法检测CoC12不同浓度对Hela细胞增殖活力的影响Hela细胞接种于96孔板，加含CoC12（0、50、100、150、200、250umol/L）的培养基，6h加MTT，4h加DMSO,振荡、酶标仪测量0D值，计算细胞存活率。1.3.2MTT法检测CoC12不同时间对Hela细胞增殖活力的影响Hela细胞接种于96孔板，0、3、6、12、24h加入含150umol/LCoC12的培养基，

6、6h加MTT4h加DMSO,振荡、酶标仪测量0D值，计算细胞存活率。1.4低氧对Hela细胞形态学的影响分低氧组、常氧组，低氧组用含终浓度为150umol/L的CoC12溶液的培养基，常氧组用正常培养基培养，处理6h后在倒置显微镜下观察细胞形态变化，镜检、拍照。1.5免疫荧光法检测低氧对Hela细胞YB-1、Vimentin、MMP-2蛋白表达的影响制备细胞爬片、固定、血淸封闭、分别滴加YB-1、Vimentin、MMP-2、YB-1与Vimentin、YB-1与MMP-2混合一抗（1:100），4°C过夜后分别

7、滴加相应的荧光标记二抗，室温避光孵育、DAH工作液染核、封片，观察、拍照。1.6统计学分析计量资料以“土s）表示，应用SPSS17.0软件对数据进行t检验；相关分析采用Pearson线性相关，P〈0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1低氧对Ilela细胞增殖的影响MTT结果显示，以50、100、150、200、250umol/L的CoC12处理Hela细胞6h后，细胞存活率分别为（117±16）%、（103±13）%、（96±17）%、（66±16）%、（55±16）%。CoC12对Hela细胞的增殖具有抑制

8、作用，且呈浓度依赖性，与未加用CoC12的细胞相比，CoC12浓度为150umol/L时显示显著的细胞抑制作用。用含150Pmol/L的CoC12培养基处理Ilela细胞3h、6h、12h、24h后细胞的存活率分别为（109±11.9）%、（103±6.5）%、（88±4.7）%、（69±14.5）%,表明CoC12作用时间越长，细胞存活率越低，与0h相比，作用后6h细胞