人参三七提取物促血管生成的信号转导机制研究

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1、人参三七提取物促血管生成的信号转导机制研究田伟雷燕朱凌群陈可冀中国中医科学院西苑医院北京中医药大学东直门医院1研究背景益气活血中药治疗冠心病取得较好疗效，促血管生成可能是的重要机制之一前期研究发现益气活血中药有促进血管生成、改善心肌缺血，增强血管内皮细胞增殖与迁移的作用，但其信号转导机制和作用靶标？2研究背景细胞信号通路是细胞应答内外环境信息，经信号网络整合作用调节基因表达及细胞增殖、分化、发育的途径。细胞的增殖、分化主要与有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径有关。Ras是调节细胞生长的重要转导蛋白，通过Ras-Raf-MAPK最后产生级联

2、反应观察人参三七提取物对血管内皮细胞血管生成信号蛋白的作用，以阐明益气活血药促血管生成信号转导途径3血管生成的过程外因——活化邻近的血管内皮细胞血管内皮细胞分泌蛋白酶降解基底膜及细胞外基质血管内皮细胞增生血管内皮细胞改组形成小管，随后吻合成网状并注入血流4研究思路中药促进内皮细胞增殖信号转导机制中药作用靶点血管生成信号通路VEGFVEGFR-2RasMAPK信号阻断VEGFR-2Ras5VEGFVEGFR①②③Ras血管生成信号通路：VEGF－VEGFR-2－Ras－MAPK6实验1人参和三七不同配比、浓度、时间对HUVEC增殖的影响配比：1：

3、1；1：2；2：1浓度：0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml时间：24h，48h00.10.20.30.40.50.612345时间（天）MTTABCDEFHUVEC不同浓度、不同时间点生长曲线图724h内皮细胞增殖直方图人参三七提取物配比：2：1浓度：4mg/ml时间：培养24hHUVEC增殖作用最强00.050.10.150.20.250.30.350.4人参：三七(1:1)人参：三七(1:2)人参：三七(2:1)空白对照组0.25mg/mL0.5mg/mL1mg/mL2mg/mL4mg/mLMTT

4、8实验2人参三七提取物促VEC增殖和分泌VEGF实验分为5组MTT检测各组细胞增殖ELISA检测上清VEGF含量人参、三七能够促进HUVEC增殖和分泌VEGF9实验3人参三七提取物促VEC上VEGFR-2表达免疫组化－SP法阳性细胞光密度阳性细胞数人参、三七能促进VEGFR-2的表达，其作用和bFGF相当10实验4人参三七提取物对血管生成信号蛋白及其mRNA的影响检测血管生成信号通路上VEGFR-2、Ras、MAPK蛋白及其mRNA表达探讨益气活血中药干预后，对血管生成信号蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK表达的影响方法：westernb

5、lotting;RT-PCR11信号蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK蛋白及其mRNA的表达ABCDEABCDE21kDβ-actinVEGFR-2β-actinRasA空白组；BbFGF组；C中药大剂量组；D中药中剂量组；E中药小剂量组各组VEGFR-2蛋白的表达各组Ras蛋白表达比较43kD43kD215kDβ-actinMAPK43kD46kD各组MAPK蛋白表达条带ABCDE12表1各组蛋白免疫印迹杂交信号强度灰度平均值比较(n=3),组别VEGFR-2/β-actinRas/β-actinMAPK/β-actin空白对照1.58±

6、0.1020.28±0.0010.38±.0110bFGF组2.11±0.211Δ0.42±0.017Δ0.58±.0206ΔΔ中药大剂量2.07±0.189Δ0.53±0.237ΔΔ0.45±.0299中药中剂量1.48±0.1730.34±0.0290.38±.0215中药小剂量1.39±0.2610.49±0.028ΔΔ0.48±.0142Δ注：与空白组比较，ΔP＜0.05；ΔΔP<0.0113血管生成信号蛋白MARK及其-mRNA的表达14结果和结论与空白组相比，中药大剂量组VEGFR-2、Ras蛋白表达明显增强，小剂量组MAPK、Ra

7、s蛋白表达明显上调。bFGF组VEGFR-2、Ras、MAPK的表达显著增强，差异均有统计学意义（P<0.05～P<0.01）人参、三七可促进血管生成信号蛋白VEGFR-2RasMAPK的表达可能是益气活血药促内皮增殖，产生血管生成效应的基础以上三个信号蛋白的mRNA表达未见增加15实验5SU5416阻断对VEGFR-2下游信号蛋白的影响及中药干预目的：观察下游信号蛋白Ras/MAPK表达，明确中药作用靶点方法：加入半数抑制量的SU5416，对信号通路关键蛋白VEGFR-2进行IC50阻断，中药干预SU5416：VEGFR-2酪氨酸激酶的抑制

8、剂，能阻断来自细胞外血管生长刺激信号和已激活信号的转化通路16SU5416阻断后，Ras表达A：空白组B：SU5416组C：SU5416+中药大剂量组