抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)卵黄免疫球蛋白(igy)的制备与性质研究

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1、抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备与性质研究黄清松，罗深秋，林元藻，曾位森【摘要】目的观察鸡卵黄中抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus,MRSA)抗体的含量、纯度、来源及稳定性。方法用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为抗原免疫Leghorn鸡；通过改良水稀释法提取卵黄中的IgY；双紫外光波长测定抗体含量,SDSPAGE电泳检测抗体纯度；RSA).MethodsTakenthemethicillinresistantstaphylococcusaureus(MRSA)asanti

2、genimmunedLeghornfoprovedethod.Antibody’scontentinedUV/VISspectrophotometer,andantibodypurityinedbyRSA);immunoglobulinofyolk(IgY);antibody　　免疫球蛋白(immunoglobulin)是具有抗体活性的一种糖蛋白，主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白可分为5类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）,其中IgG是最主要的免疫球蛋白。而母鸡血液

3、中的免疫球蛋白可传递到鸡卵黄中，并且在鸡发育过程中起保护作用，此种免疫球蛋白称为鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)〔1〕。IgG是存在于鸡卵黄中的主要免疫球蛋白,而IgM和IgA则主要存在于血清蛋白中〔2〕。IgY属多克隆抗体，多克隆抗体在疾病的诊断和防治方面具有许多特定优点，通常一次性大量制备是相当困难的，而多次制备又导致抗体的均一性差。母鸡一经免疫应答后，可从其卵黄中不断获得特异性的抗体。IgY纯度高、特异性强，不会像其他哺乳动物产生的抗体那样会发生交叉血清反应或过敏反应,因而它是最安全的生物制剂，可替代免疫小鼠、豚鼠或兔等哺乳动物所制备的抗体而大量生产。近年来，IgY的研究和应用是免疫学领域的热

4、点和十分活跃的课题。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是引起院内感染的重要致病菌，其致病性强，对多种抗菌药物耐药，在治疗上十分棘手。本文用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作为抗原免疫母鸡制备了抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IgY〔3，4〕，并对其理化性质和生物学活性进行了研究，旨在为其以后的诊断和防治应用奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物Leghorn鸡，25周龄，购于华南农业大学实验动物中心，合格证号：2007A025，常规饲养。　　1.1.2试剂TrisHCl缓冲液；硫酸铵；PBS缓冲液；SDSPAGE成套电泳试剂；考马斯亮蓝R250(购自北京索莱宝科技有限公司)；聚苯乙烯酶标板(

5、96孔，浙江黄岩新丰塑料制品厂出品)；兔抗鸡卵黄免疫球蛋白IgG（上海生物制品所血液制品室提供）。　　1.1.3菌种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA标准菌株ATCC25923)获自中国药品生物制品鉴定所。　　1.1.4仪器高速冷冻离心机(HC3018R型,科大创新股份有限公司)；电泳仪(DYYII2，北京六一仪器厂)；酶联免疫检测仪（MR2000型，南京思腾医疗器械有限公司）；微量进样器。　　1.2方法　　1.2.1免疫抗原的制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌经接种，摇瓶传代扩大培养后，收集MRSA，用生理盐水反复洗涤3次，离心收集置于0.4%（φ）的甲醛溶液中，于37℃24h灭活，用pH7

6、.0的0.01mol/LPBS缓冲液洗涤3次，将菌液调成2×109/mL备用。取等量的菌液和不完全福氏佐剂(羊毛脂∶液体石蜡=7∶3)混合，每毫升混合液中加入卡介苗2.5mL，充分乳化后作为免疫抗原备用。　　1.2.2母鸡免疫12只产蛋母鸡随机分成实验组和对照组,每组6只。实验组每只每次注射1mL免疫原，同时注射4个部位:双翅膀皮下和左右背部皮下注射，每周1次，连续注射3周。免疫后第16天测定鸡血清IgG效价(>1∶2000)，第21天开始拣取免疫蛋。对照组用相同方法注射生理盐水。以后每月强化免疫1次。　　1.2.3抗MRSA卵黄免疫球蛋白(IgY)的分离和纯化采用改良水稀释法(RSA用

7、10%（φ）甲醛固定过夜后用pH8.5碳酸盐缓冲液稀释为3×108cfu/mL。②包被96孔酶联板，4℃下放置72h。③依次加入不同预处理后的IgY稀释液(每样品各做2孔)；兔抗鸡IgG(稀释浓度1∶1000)；底物液显色30min后滴加1滴2mol/L硫酸终止反应。④490nm比色。检测所用洗涤液为0.05%Tol/LPBS，阳性对照为未处理IgY稀释液，阴性对照为未免疫鸡蛋卵黄提取液物。　　２