十一次目基因pcr扩增与检测

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1、分子生物学实验实验十一目的基因的PCR扩增与检测第2周分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍第3周从植物组织提取DNA第4周从动物组织提取DNA第5周原核细胞质粒DNA的提取第6周核酸的琼脂糖凝胶电泳第7周紫外分光光度法测定核酸含量和纯度鉴定第8周限制性内切酶酶切质粒DNA第9周凝胶电泳回收和纯化DNA片段第10周细菌感受态的制备第11周质粒DNA的转化第12周目的基因的PCR扩增与检测第13周原核蛋白质SDS-PAGE电泳第14周考试一、实验目的：熟悉PCR方法体外扩增DNA的基本原理，掌握PCR技术的常规操作，了解PCR引物及参数的设计。利用PCR扩增

2、的方法获取用于表达的目的基因（CYP6B6）。二、实验原理：PCR扩增是一种类似于DNA的天然复制过程，以待增的DNA为模板、在体外由引物介导的酶促合成特异性DNA片段的方法。PCR方法体外扩增DNA的基本原理图示预变性(双链DNA解链)94C,5min变性(94C,30s-1min)复性（引物与单链DNA结合）55C,30s-1min延伸(72C,1-3min)总延伸(72C,5-10min)(25-35cycles)PCR的一般过程：经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。（1）引物长度应为15~30个核苷酸，Tm可按下列简单公式计算

3、：Tm=（G+C）x4+（A+T）+35-2n（2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。（3）G+C碱基的含量在45%~55%左右。（4）两个引物在3端均必须与模板互补，5端可以不互补。（5）引物自身连续互补碱基小于4个。（6）引物之间连续互补碱基亦应小于4。引物设计的一般原则设计和选择高效而且特异性好的引物是PCR的关键循环参数：①变性（denaturation）变性是高温短时，94C，30s-1min。同时在第一轮循环前先进行94℃预变性5min，以便使模板DNA完全解链。②退火（annealing）实际使用的退火温度要比

4、引物的Tm低5℃。退火温度在55~72℃之间都会得到好的结果。③延伸（extension）一般引物延伸是在72℃下进行。对2Kb长的产品扩增时间多采用1min。④循环次数（cycle）一般为30个循环，如果循环次数过多会增加非特异性产物的量。1、55℃*30s90s**7min45s1.取一个0.2mleppendorf管，添加以下各种成分反应液ddH2O12.1µl模板DNA0.5µl（20-40ng）原质粒进行1：20倍稀释上游引物(100µmol/L)0.3µl下游引物(100µmol/L)0.3µldNTPmixture(10mmol/L)2µl10倍×

5、缓冲液2.5µlTaq酶0.4µl总体积20µl2.稍作离心，将反应管放入PCR仪中。2、反应体系:(CYP6B6)3.设定反应程序：94℃条件下使模板DNA预变性5min。变性94℃30s退火55℃45s30cycles延伸72℃90s最后在72℃条件进行延伸7min。4℃保温4.取8µl反应液用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。