稳定表达egfrviii的u87mg细胞株的建立与鉴定论文

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1、稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株的建立与鉴定论文陈明孙红宇文荣朝余政梁吴巧琪夏许可张兴梅高天明【摘要】目的：构建稳定表达表皮生长因子受体III型突变体(EGFRvIII)的U87MG细胞株。方法：采用电转染方法将pcDNA4/TOEGFRvIII质粒导入U87MG细胞，加入zeocin筛选，进一步将细胞有限稀释并克隆化培养以建立稳定的转染细胞株。应用RTPCR、G细胞株，为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供基础。【关键词】EGFRvIII;U87MG细胞;基因表达表皮生长因子受体(epidermalgroal

2、groynA.Habib教授惠赠。DMEM培养基及Zeocin购自Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，小鼠抗EGFR单克隆抗体购自Biosource公司，RNAiso试剂购自TaKaRa公司，RTPCR试剂盒购自Promega公司，RTPCR引物在TaKaRa公司合成。1.2U87MG细胞培养及转染U87MG培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱常规培养。转染前2～3天进行细胞传代。1.3细胞转染及稳定株筛选采用amaxa电转染仪电转染细胞。转染时胰酶消化并离心收集细胞

3、，计数并准备5×105个细胞/电转染。将细胞重悬于100μl电转液并加入2μgpcDNA4/TO或pcDNA4/TOEGFRvIII质粒进行电转染，然后置于37℃、5%CO2培养箱常规培养。转染后24小时免疫荧光染色观察瞬时转染效果。培养细胞中加入zeocin工作液，终浓度100μg/ml，每3天换培养液。培养14天后，将细胞有限稀释并克隆化培养于96孔培养板中，倒置显微镜下观察并挑选单克隆细胞进一步扩大培养并鉴定。1.4RNA抽提及反转录聚合酶链反应(RTPCR)RNA抽提采用RNAiso裂解细胞，加入氯仿离心后收

4、集上清层，然后异丙醇、乙醇沉淀得到总RNA。用于检测EGFR和EGFRvIII的RTPCR引物序列为：5'CAGTATTGATCGGGAGAG3'和5'CATCTCATAGCTGTCGGC3'。反应体系中含有dNTP0.2mM，引物各1μM，MgSO41mM，AMV逆转录酶0.1U/μl，TflDNA聚合酶0.1U/μl，RNA模板1μl，设置无模板对照，以高表达EGFR基因的A431细胞作为阳性对照。RT反应条件为：45℃，5min;94℃，2min。PCR反应条件为：94℃，30s;60℃，1min;68℃，

5、2min;反应30个循环后，68℃，7min。同时进行GAPDH的RTPCR作为内参照。反应结束后进行2%琼脂糖凝胶电泳观察并摄相。1.5蛋白免疫印迹(Tris，5%β巯基乙醇，2%SDS，10%甘油及0.05%溴酚蓝)室温抽提蛋白质。取蛋白样品进行8%SDSPAGE电泳后电转移至PVDF膜。室温下用含5%脱脂奶粉的0.1%Tl)衬染细胞核后于荧光显微镜下观察并摄像。2结果2.1RTPCR检测EGFRvIII基因的表达1：DNAMarker;2：A431细胞;3：V24号克隆;4：V10号克隆;5：V6号克隆;6：

6、pcDNA4质粒转染单克隆;7：未转染U87MG细胞;8：无模板对照。图1RTPCR方法检测单克隆细胞株EGFRvIII表达如图1所示，RTPCR反应扩增后，阳性对照A431细胞检测到EGFR基因表达(998bp)，V24号和V6号单克隆细胞株检测到EGFRvIII基因(197bp)表达，V10号单克隆细胞株未检测到目的基因表达。各细胞株均检测到作为内对照的GAPDH基因(171bp)。2.2G细胞本身不表达EGFRvIII蛋白，V6号单克隆细胞株检测到EGFRvIII蛋白强表达，V10号单克隆细胞株检测不到EGFRv

7、III蛋白表达。1：A431细胞;2：未转染U87MG细胞;3：V6号克隆;4：V10号克隆。图2各单克隆细胞株细胞EGFRvIII基因的蛋白水平表达2.3细胞免疫荧光染色检测EGFRvIII的表达免疫荧光染色显示，不含目的基因的对照质粒pcDNA4/TO转染后筛选得到的单克隆细胞株未见到EGFR或EGFRvIII蛋白表达，而稳定转染pcDNA4/TOEGFRvIII质粒的V6号单克隆细胞株可见EGFRvIII蛋白表达，且表达主要位于细胞膜上(图3)。左上和左下：分别为转染空载体pcDNA4/TO后免疫荧光检测EGFRv

8、III蛋白表达和DAPI染核。右上和右下：分别为V6号单克隆细胞株免疫荧光检测EGFRvIII蛋白表达和DAPI染核。图3细胞免疫荧光染色检测到V6号细胞株EGFRIII蛋白大量表达(×400)3讨论胶质瘤占所有脑肿瘤的70%，其中多形性胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme，GBM