稳定表达核仁素的h9c2细胞株的建立和鉴定

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1、稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定作者：宋娟张任飞张彬蒋碧【摘要】目的：建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型。方法：将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞，使核仁素在细胞内表达，用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株；用双酶切、DNA测序鉴定质粒，用RT-PCR及ethods:ThepCMV-Tag2B-Nucplasmididedbydouble-enzymedigestionandsequencing.Resu

2、lts:AfterG418screening,paredRNAandprotEinofnucleolinintransfectedcelllineonstratedbytheRT-PCRandEM培养基，Gibco公司产；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠或羊抗兔或羊抗小鼠IgG，Sigma公司产；无支原体胎牛血清，杭州四季清生物工程公司产；LipofectamineTM2000转染试剂盒，Invitrogenlifetechnologies公司产。鼠抗C23单克隆抗体，SantaCruz公司产；质粒抽提试剂盒，大连TaK

3、aRa公司产；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物技术公司产；Trizol试剂，GibcoBRL公司产。1.2.H9C2细胞培养大鼠心肌细胞株（H9C2）用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞于37℃，5%CO2条件下培养，待细胞生长至约85%的融合状态用于实验。1.3质粒扩增、抽提及鉴定质粒转化感受态细菌DH5α，挑取阳性克隆进行扩增；质粒抽提依试剂盒说明书进行；用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒，一部分1％琼脂糖胶电泳，拍照；另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。1.4脂质体转染根据生命技术公司提供的转染操作

4、说明书进行。细胞用无血清DMEM培基洗涤3次后，加入质粒与脂质体的混合物，37℃，5%的CO2培养箱中培养，6h后再加入4mL含10%小牛血清的DMEM培基，24h后，按1∶10进行分瓶培养。第2d加入含1000μg/mLG418和10%胎牛血清的DMEM培养基进行筛选4周。同时转染pCMV-Tag2B空载体，用G418进行同样筛选后用于对照。1.5免疫印迹按实验室常规方法进行。用2×SDS裂解缓冲液裂解细胞，收集细胞总蛋白质，采用Bradford法进行蛋白定量，30μg蛋白经10%～12%SDS-PAGE电泳6h后，电转（

5、4℃，过夜）至PVDF膜，2%BSA室温封闭3h，先后加入靶蛋白抗体及HRP标记的相应IgG，室温分别孵育1h和0.5h，DAB显色试剂盒进行显色。1.6细胞总RNA提取按实验室常规方法进行。弃培养液，加1mLTrizol/2×106细胞，裂解细胞，细胞裂解物转移到2mLEppdorf管中，室温放置5min，加0.2mL氯仿/1mLTrizol，剧烈震荡15s，室温放置3min，4℃离心，细胞裂解液分为三层，小心吸取上层水相转移到新的1.5mLEppendorf管中，加0.5mL异丙醇/1mLTrizol，室温放置10min

6、，4℃离心，小心去掉上清，加1mL75％乙醇洗白色沉淀物，离心后去掉乙醇，空气干燥约10min，用10μL～20μLDEPC处理过的水重悬RNA，测量1∶100稀释样品的光密度（OD260）来计算浓度。浓度（μg/mL）=(稀释度)［（40μg/mL.OD260）］(样品的OD260)，重悬的RNA放置-80　℃冰箱保存。1.7逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）用逆转录酶MMLV合成第一链。根据公司提供的使用说明书进行。取1μgRNA与oligDT在70　℃反应5min，置于冰上，加入dNTP、buffer、Rnasin，3

7、7℃反应5min后置于冰上；加入MMLV，42　℃反应1h，72℃反应10　min。用2.5μL的逆转录产物作为模板，按如下的反应条件进行PCR扩增：C23：F:cgcggatcccatggtgaagctcgc；B：cggggtacctattcaaacttcgtcttct94℃变性30　s，55　℃退火30　s，72　℃延伸2　min，扩增31个循环；GAPDH：F：acccagaagactgtggatggB：ttctagacggcaggtcaggt94℃变性30　s，58　℃退火30　s，72　℃延伸1　min，扩增22个

8、循环。2结果2.1质粒鉴定质粒pCMV-Tag2B-Nuc经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，产物在一部分1％琼脂糖胶电泳，另一部分送上海博亚生物技术有限公司测序。将未经酶切质粒与质粒酶切产物均行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。酶切产物出现约2.1kb大小片段，大小与预期一致。测序结