园艺植物生物技术

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1、园艺植物生物技术第八章园艺植物基因的分离克隆主要内容文库筛选法图位克隆技术转座子标签法基因差异表达技术同源序列法基因芯片技术第一节文库筛选园艺植物基因组文库的构建园艺植物cDNA文库的构建目的基因的筛选一、园艺植物基因组文库的构建(一)基因文库的定义及类型1.定义一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。2.类型基因组文库:植物基因组全部DNA片段组成的基因文库,反映基因组的全部遗传信息。cDNA文库:将某一特定组织表达的mRNA反转录成cDNA组成的基因文库，每个克隆只含1种mRNA信息,足够数目克隆则包含细胞全部mRNA信息。cDNA便于克隆和大量扩增,不像基因组DNA含有内含子

2、很难表达。一、园艺植物基因组文库的构建(二)构建的植物基因组文库需要满足的条件文库能够覆盖整个基因组;插入的DNA片段比较大;文库易于保存且较稳定一、园艺植物基因组文库的构建(三)载体的制备1.完整的基因组文库所需要筛选的重组子数目N=In(1-P)/In(1-f)N,重组子的数量;P,所要求的概率;f,某一插入片段与相应生物基因组大小的比值.要以0.99的概充获得番茄基因组(9.5×108bp)20kb的插入片段,所需要筛选的重组子数为:N=In(1-0.99)/In[1-(2×104/9.5×108)]=2.2×1052.载体的选择a)质粒载体可承载15kbDNA左右片段(有

3、效范围为10kb)b)载体可承载25kbDNA左右片段(有效范围为15kb)c)Cosmid载体可承载45kbDNA左右片段(有效范围为40kb)一、园艺植物基因组文库的构建3.载体制备要求:纯度高,去磷酸效果好去磷酸化是为了提高载体和目标片段的连接效率纯度如果不高则会在重组克隆中含有大量的细菌基因组DNA,影响文库的质量.一、园艺植物基因组文库的构建(四)大片段基因组DNA的制备要求:一般提取的DNA相对分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3-5倍如插入片段达到100kb以上,则要求提取的基因组DNA分子量要达到500kb以上实践证明:提取的基因组DNA分子量越大

4、,得到的重组克隆的插入片段越大一、园艺植物基因组文库的构建基因组DNA的不完全酶切1.根据实验需要选择合择的限制性内切酶1)四个识别位点的限制酶出现的几率:1/2562)六个识别位点的限制酶出现的几率:1/40962.分离目的酶切片段大小的确定1)克隆单个基因:10kb2)克隆基因族:20kb一、园艺植物基因组文库的构建基因组DNA的不完全酶切3.DNA不完全酶切条件的确定1)确定限制酶用量,改变酶切时间2)固定酶切时间,改变限制酶的用量一、园艺植物基因组文库的构建DNA的不完全酶切(五)大片段DNA(酶切片段)与克隆载体连接1.酶切片段的分离与纯化1)低熔点琼脂糖回收目的片

5、段2)试剂盒回收目的片段一、园艺植物基因组文库的构建(五)大片段DNA(酶切片段)与克隆载体连接2.克隆载体连接连接体系中的四种连接方式:载体自连;载体和基因组DNA片段连接;基因组DNA片段的自连和基因组片段之间连接只有基因组DNA和载体之间的连接才是所需要的,如何提高它们之间的连接效率是连接反应的关键.可以通过调整载体与基因组DNA的比例来达到较好的效果.(载体与外源片段的比例为1:5-1:15)一、园艺植物基因组文库的构建基因组DNA片段3凹端的不完全补平的策略(六)载体的遗传转化电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段插入片段越大，转化效率越低(七)克隆的挑取、验证从文库

6、中随机挑选一定量的克隆，摇菌，提取质粒DNA，酶切脉冲电泳检查插入片段的大小，并根据数目计算空载率。细胞器DNA的污染会降低文库的实际容载量，一般用线粒体和叶绿体的探针对文库进行检测。一、园艺植物基因组文库的构建(八)文库的扩增、分装及保存1.基因组DNA文库的保存1)影印滤膜保存法一、园艺植物基因组文库的构建(八)文库的扩增、分装及保存2.文库在液体培养基中扩增保存1)从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70℃储存(加终浓度为25%的甘油).缺点:因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少.一、园艺植物

7、基因组文库的构建(八)文库的扩增、分装及保存2.文库在液体培养基中扩增保存2)从平板上挑选单个克隆子接各种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70℃或-25℃下保存缺点：需要保存的克隆子数过多，工作量大一、园艺植物基因组文库的构建二、园艺植物cDNA文库的构建真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是mRNA的100倍左右，而含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的