纤维粘连蛋白eda+片段在退变椎间盘中的表达及其意义

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1、纤维粘连蛋白EDA+片段在退变椎间盘中的表达及其意义作者：胡宝山，丁悦，李春海，刘尚礼，吕浩然，叶伟【关键词】椎间盘退变摘要：［目的］检测退变椎间盘内EDA+Fn的表达，探讨损伤在椎间盘退变中的作用。［方法］收集人腰椎间盘退变临床手术标本，经病理证实均发生退变，采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术扩增目标条带。［结果］正常椎间盘内没有EDA+Fn的表达，而退变椎间盘内均有EDA+Fn的表达；中重度退变者EDA+Fn的表达较轻度退变者为多（轻中度组间P=0016＜005；轻重度组间P=0007＜0

2、05），中重度之间则没有明显差别（P≥0501）。［结论］EDA+Fn在退变椎间盘内有较高表达，直接证明损伤是椎间盘退变的重要的致病因素之一。关键词：椎间盘退变；纤维粘连蛋白；可变剪接Abstract：［Objective］Tostudytherelationshipbetaandthelumbardiscdegenerationandtodetecttheexpressionofthefibronectinsplicingvariantsinthedegeneratedlumbarinterver

3、tebraldisc,andstudytheexpressionofEDA［Method］ThehumanlumbarintervertebraldisctissuesplifiedbyRTPCRtechnique［Result］EDA+Fnofnormallumbarintervertebraldiscbarintervertebraldiscbardegeneratedintervertebraldisc,andthetraumaisoneofprerequisitefactorsinthedi

4、scdegeneratedprocessprobablelyKeyega公司）；PCR试剂盒（TaKaRa宝生物工程公司）：引物由上海生工生物工程公司合成，分别为：EDA，5′GACTATTGAAGGCTTGCAGCC3′（sense），5′CTTGTGGGTGTGACCTGAGTG3′（antisense）（扩增长度包含EDA片段495bp，不包含EDA片段356bp）;GAPDH，5′TCTTCTTITGCGTCGCCAGC3′（sense），5′GAGGCAGGGATGATGTTCTG3′（a

5、ntisense）（扩增长度453bp）。12MRI确定椎间盘退变与否的标准取矢状位MRIT2加权图像，重复时间2500ms，回波时间90ms。图像由有经验的专业医师行双盲评定。结果按SchnEidermans分级，标准为：1级（正常）：正常信号强度；2级（轻度）：椎间盘信号轻度减低；3级（中度）：信号重度减轻；4级（重度）：椎间盘信号完全消失。对照组均为1级，实验组2级4个标本，3级3个标本，4级3个标本。13RTPCR反应液氮研磨各组组织标本后，抽提总RNA，进行RTPCR扩增，每管加入待测基因

6、引物进行扩增，EDA扩增PCR反应体系采用94℃5min、94℃30s、56℃30s、72℃30s进行30个循环，总反应体系50μl。GAPDH反应条件与EDA相同，反应结束后，取5μl反应产物加入2μl6×上样缓冲液，1μl金胶体，2％琼脂糖电泳，UVP凝胶成像，利用凝胶分析软件，用待测EDA+基因与内参基因扩增的特异性条带的光密度积分值的比值反应待测基因表达的强弱。标准分子量参照TaKaRa公司100bpDNALadder（长度分别为100、200、300、400、500、600、700、800

7、、900、1000bp）。14统计学处理实验数据均以均数±标准差（x-±s）表示，采用方差分析，监测各组之间mRNA的表达有无统计学意义。2结果正常和退变椎间盘标本均扩增出EDA+片段（356bp）高亮度条带，其中正常椎间盘组（n=3）均没有EDA+片段（495bp）表达（图1）。退变组均有EDA+片段的表达，以内参为标准（图2），进行半定量分析发现，EDA+片段表达与椎间盘退变的程度关系密切，中重度退变者EDA+Fn的表达较轻度退变者为多（轻中度组间F=12769，P=0016＜005；轻重度组间

8、F=19820，P=0007＜005），中重度之间则没有明显差别（F=0545，P=0501＞005）。图1EDA片段mRNA在退变椎间盘中的表达〔注：从左至右M：DNAmarker;Nor:正常组；D1：轻度退变组；D2：中度退变组；D3：重建退变组。扩增片段：EDA+片段（495bp上方条带）；EDA+片段（356bp下方条带）；marker为100~1000bp〕图2各标本的GAPDH内参条带（453bp）　　3讨论下腰痛是脊柱外科的常见病和多发病。是导致成人丧