Sox9和Ⅱ型胶原蛋白在人腰椎间盘退变中的表达及意义.doc

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1、Sox9和II型胶原蛋白在人腰椎间盘退变中的表达及音义［摘要］目的探讨Sox9和II型胶原蛋白(Col2al)在人类腰椎间盘退变中的表达及意义。方法应用免疫组织化学在退变和正常腰椎间盘组织中分别检测Sox9和II型胶原蛋白的表达，并分析其相关性。结果实验组Sox9染色阳性率为20.0%(6/30),对照组Sox9染色阳性率为76.7%(23/30),两组间染色阳性率有显著性差异(P<0.05)o实验组Col2al染色阳性率为33.3%(10/30),对照组Col2al染色阳性率为83.3%(25/30),两组间染色阳性率有显著性差异(P〈0・05)°退变腰椎间盘

2、中6例Sox9阳性者中，仅］例Col2al表达阴性，而在10例Col2al表达阳性者中，5例Sox9表达阴性，二者同时阳性5例，同时阴性表达19例。退变椎间盘中Sox9和Col2al的表达呈显著正相关(P<0.05)o结论Sox9和II型胶原蛋白表达降低与腰椎间盘退变有关，Sox9可能通过下调Col2al的表达，共同参与腰椎间盘退变。［关键词］Sox9；II型胶原蛋白；腰椎间盘退变；免疫组织化学［中图分类号］R363.2［文献标识码］A［文章编号］2095-0616(2014)03-18-04随着老龄化社会在中国的到来，颈、腰椎椎间盘退变所致颈肩痛、腰腿痛的发病

3、率已逐渐增高，并口每年均要耗费相当的人力财力进行治疗。其治疗手段主耍包括保守治疗和手术治疗，然而无论是脱水、镇痛、理疗等保守治疗还是各种微创或开放手术方法均不能从根本上阻止椎间盘退变的发生和发展，并且手术治疗还可能破坏脊柱运动的生理完整性，具有易复发、胃肠道反应等风险和并发症［1］。因此在已有研究基础上，针对椎间盘退变的靶点基因，通过基因治疗的方法来阻止或改变椎间盘退变，以成为颈腰椎疾病基础研究的热点课题之一。Sox9(SRYrelatedhighmobilitygroupboxgene9)基因最早是作为早期胚胎发育相关基因而被发现，但在之后的研究中逐渐被发现具

4、有调控软骨细胞发育、成熟的重要功能［2-3］o比如在关节炎患者屮致炎因子通过抑制Sox9的软骨调控作用，减弱病变软骨的再生和修复，从而引起关节炎迁延不愈［4］。而同样以软骨样细胞为主的椎间盘组织中Sox9基因的表达情况如何呢？我们采用免疫组织化学研究腰椎间盘退变临床标木中Sox9及其下游Col2al(II型胶原蛋白)的表达情况，并探讨其机制,以期为分子水平预防和治疗人类椎间盘退变性疾病提供实验基础。1材料与方法1.1材料选取2010年1月〜2012年12月于我院住院因腰椎间盘突出症、腰椎滑脱、腰椎管狭窄等入院示路手术所取得的腰椎间盘患者30例作为实验组，患者年龄

5、均＞50岁，其屮男16例，女14例，标本均经病理证实为退变椎间盘。选取腰椎外伤后路手术取出腰椎间盘标木30例作为对照组，患者年龄16〜30岁，标本均经病理证实为正常椎间盘，其中男18例，女12例。1.2主要试剂Sox9兔多克隆抗体、Col2al鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，即用型超敏S-P免疫组化试剂盒、DAB显色液为福州迈新生物工程有限公司产詁。多聚赖氨酸购自sigma公司。1.3实验方法1.3.1标本制备标本均经4%多聚甲醛固定6~8ho常规脱水，石蜡包埋，切片，采用IIE染色和免疫组化染色。1.3.2免疫组织化学染色采用S-卩免疫组织化

6、学染色超敏试剂盒，按期说明书进行实验。石蜡切片脱蜡至水，蒸憾水洗5minX2次，蒸憾水新鲜配制3%过氧化氢液，灭活内源性过氧化物酶，卩BS洗3minX3次。将切片浸入0.01M枸椽酸盐缓冲液，微波炉加热沸腾,5〜lOmin后，反复1~2次；PBS洗3minX3次，封闭血清37°C孵育lOmin；滴加一抗，4°C孵育12h,PBS洗3minX3次；滴加生物素标记的二抗，37C孵育lOmin,PBS洗3minX3次；滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，37°C孵育lOmin,卩BS洗3minX3次；滴加DAB显色剂，镜下确定反应时间终止。显色完成后，苏木素复染，梯度

7、酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封丿h显微镜下观察染色结果。1.3.3染色结果的判断标准Sox9位于胞核，Col2al位于胞浆,阳性细胞染色呈棕黄色，随机计数10个视野，阴性(-)判定为无阳性细胞或阳性细胞比例60%o1.4统计学方法采用SPSS15.0软件进行统计，两样本率的差别检验采用x2检验，相关性检验采用2X2列联表关联性分析，以a=0.05作为检验标准。2结果2.1退变腰椎间盘中Sox9的表达阳性细胞胞核呈棕黄色（图1A）O实验组Sox9染色阳性率为20.0%（6/30）,其中阴性（-）24例，弱阳性（+）2例，中度阳性（++）3例，强阳性（+++）1例

8、。对照组Sox9染色阳性