苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞突变机制的分析

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1、苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞突变机制的研究苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞突变机制的研究摘要苏丹红是一种人工合成的红色染料，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种类型，被广泛用于溶剂、油、蜡、汽油的增色以及鞋、地板等增光方面，然而苏丹红也被非法添加入食品中以保持其色泽。研究表明，苏丹红对小鼠淋巴瘤细胞有显著的细胞毒性和致突变作用，摄入含较高剂量苏丹红的食品就会增加致癌的危险性。本研究中我们进一步阐明苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的致突变分子机制，本试验采用“小鼠淋巴瘤细胞L5178Y/TK+/-致突变检测方法”（L5178Y/TK+/-MouseLymphomaMutationAssay，

2、MLA）来获得胸苷激酶基因（tk）突变克隆。为了检测含功能性tk基因的11号染色体（11b）上DNA断裂情况，我们挑取对照组和经不同浓度苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ处理小鼠淋巴瘤L5178Ytk+/--3.7.2细胞得到的tk基因突变克隆，提取DNA，用基于PCR的杂合性缺失（Lossofheterozygosity，LOH）的分析方法考察11号染色体上分布的tk位点的杂合性缺失情况。最后通过Hoechst33342/PI双荧光活染法检测经苏丹Ⅲ和Ⅳ处理的细胞凋亡情况。从检测结果来看150µg/mL苏丹Ⅰ诱导的突变体中大克隆和小克隆发生LOH的比例分别为85%(17/20）、95

3、%(19/20)，所有克隆发生LOH的比例为90%(36/40)；150µg/mL苏丹Ⅲ诱导的突变体中大克隆和小克隆发生LOH的比例分别为85.2%（23/27）、100%(15/15)，所有克隆发生LOH第IV页共57页苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞突变机制的研究的比例为90.5%(38/42)；500µg/mL苏丹Ⅳ号组中大克隆和小克隆发生LOH的比例分别为83.3%（15/18）、90.9%(19/22)，所有克隆发生LOH的比例为85%(34/40)。Hoechst33342/PI双荧光活染法表明在苏丹Ⅲ作用12、24和48小时其凋亡率分别为10.5％、2

4、9.5％、52.5％，在苏丹Ⅳ作用12、24和48小时其凋亡率分别为14.5％、28.0％、49.5％，随诱导时间的延长，凋亡率增高，呈时间依赖关系。关键词：苏丹Ⅰ，苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，胸苷激酶基因，小鼠淋巴瘤细胞试验杂合性缺失，Hoechst33342/PI双荧光活染法第V页共57页苏丹Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ诱导小鼠淋巴瘤细胞突变机制的研究MUTAGENICEFFECTSOFSUDANⅠ、ⅢANDⅣINL5178Y/TK+/--3.7.2CMOUSELYMPHOMACELLSABSTRACTSudanisakindofman-madereddyeincludingSudanⅠ、Ⅱ

5、、ⅢandⅣ.Sudaniswidelyusedformaintainingthecolourofoil,wax,shoesandfloor.However,Sudanisalsoappliedtomaintainthecolouroffood,whichcancausesomeseriousresults.ResearchrevealedthatSudancaninducesignificantcytotoxicandmutageniceffectsonmouselymphomacellsandincreasetheriskofcancer.Inthisstudy

6、,weelucidatemolecularmechanismofmutageniceffectswhichareinducedbySudanⅠ,ⅡandⅣinL5178Ytk+/--3.7.2C-mouselymphomacells.WeusedL5178Y/TK+/-MouseLymphomaAssay(MLA)togaintkmutants.Toindentifytheclastogeniceventsonthetk+bearingchromosome11b,weanalyzedDNAisolatedfromtkmutantsfromdifferentConce

7、ntrationofSudanⅠ,ⅢandⅣtreatmentgroupbyaPCR-basedmethodtodetectlossofheterozygosity(LOH)onTklocuswhichisdistributedinchromosome11.FinallyHoechst33342andPIdoublefluorescencestainisusedtodetectcellapoptosis.Studyshowsthat85%ofthelargecolonymutantsand95%ofthesmallcolonymutantstreatedby15