小鼠淋巴瘤细胞(l5178y)tk基因突变试验预实验方法

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1、小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK基因突变试验1.目的：在正式试验开始之前需要确定供试品的溶解性并确定适宜的供试品剂量范围。2.剂量：剂量设计试验通常不考虑供试品的溶解性，分别在有和无S9的情况下接受3小时处理，最高浓度可达5mg/ml（即使其溶解度大于5mg/ml，也就是说这是最大的剂量）；以2倍稀释度向下设6－10个剂量。3.溶剂：溶剂的选择按其优先顺序依次是RPMI-0、生理盐水、蒸馏水和DMSO，要尽量避免悬浮液，如果供试品不可溶，应用RPMI-0将其制成悬浮液。4.方法：4.1收集细胞。细胞总量应达到6×107个，用RPMI-10培养基悬浮备用。（收集过程中每天应调

2、整细胞的细胞量为2×105/ml，）。4.2将10mlRPMI-10培养基（约含107个细胞）分别置于一系列50ml一次性消毒离心管中。为使处理用培养基中血清含量降至5％（V/V），RPMI-0、溶剂、供试品、1mlS9混合物（代谢活化系统时）或150mMKCL（非代谢活化系统时）加入离心管的总体积应达到20ml（如表所示）。表处理时培养基的组成成分成分体积无活化系统有活化系统细胞悬液（106/mlRPMI-10）10ml(107个细胞)10ml(107个细胞)RPMI-08.8ml8.8mlS9混合物－1ml150mMKCL1ml--供试品0.2ml0.2ml将离心管塞紧并

3、置于振荡器上，37℃水浴3小时。然后低速离心（1000r.p.m）5分钟，弃去上清液，用PBS(PH7.4)洗涤细胞两次。重新悬浮细胞于50mlRPMI-10之中，并调整细胞密度为2×105/ml，,转移至培养瓶中。培养2天。每天计数细胞生长（DCG），并调细胞密度为2×105/ml左右。5.结果按第1d、第2d的DCG计算相对悬浮生长（RSG）.选择10％－20％RSG作为诱变试验的最高剂量，并以2倍稀释度向下设2－5个剂量。6.计算方法RSG＝〔DCG1×DCG2(供试品组)/DCG1×DCG2(对照组)〕DCG1为第一天的生长率，DCG2为第二天的生长率。DCG为：次日

4、细胞密度/配制或稀释后的细胞密度。