《GB15193.20-2003-TK基因突变试验》.pdf

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1、ICS07.100C53中华人民共和国国家标准GB15193.20-2003TK基因突变试验TKgenemutationtest2003-09-24发布2004-05-01实施中中华人民共和国卫生部发布国国家标准化管理委员会GB15193.20-2003前言本标准全文强制。本标准参考美国FDA营养素补充剂与食品安全中心食品添加剂安全办公室发布的“食品成分安全评价毒理学原则2000年版红皮书(2001年9月发布):IV.C.Lc.小鼠淋巴瘤胸腺嗜吮激酶基因突变试验(IV.C.1.c.MouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssay

2、)".本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:四川大学华西公共卫生学院、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人:张立实、张建清、帅培强、王怡净。本标准首次发布。GB15193.20-2003TK基因突变试验范围本标准规定了体外哺乳类细胞TK位点基因突变试验的基本技术要求与方法本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂(含营养强化剂)、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、

3、食品工业用微生物等。2原理TK基因突变试验的检测终点是胸昔激酶(thymidinekinase,TK)基因的突变。在人类，TK基因定位于17号染色体长臂远端;在小鼠则定位于11号染色体。故TK基因的突变属于常染色体基因突变。TK基因的产物胸昔激酶在体内催化从脱氧胸昔(TdR)生成胸昔酸(TMP)的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嚓吮核昔酸(dUMP)，即由胸昔酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加人胸昔类似物(如三氟胸昔，即TFT一一trifluorothymidine)，则TFT在胸普激酶的催化下可

4、生成三氟胸昔酸，进而掺人DNA,造成致死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸昔激酶缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺人DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数，计算突变频率，以判定受试物的致突变性3试剂与材料3.1细胞:L5178Ytk"-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。为清除自发突变的tk-/一基因型细胞，在正式实验前，应使用含3pg/mI胸昔,5pg/ml一次黄嗦吟,0.1pg/mL氨甲碟吟和7.5pg/mL甘氨酸的THMG培养基中处理24h,离心、洗涤后在不含氨甲碟岭的THMG培养基中培养3天。3.2试剂:

5、PBS磷酸盐缓冲液，三氟胸昔(trifluorothyrnidine)，次黄嗓吟(hypoxanthine)，甘氨酸(gly-cine),氨甲碟吟(methotrexate)，胸腺嗜吮核昔(thymidine)，阳性对照物(MMS,MMC，环磷酞胺等)4试验设计一般应进行细胞毒性预试验，根据预试验结果，在相对存活率(relativesurvival,RS)为明性对照组的20%-80%范围内设3个一4个剂量(浓度)水平。每次试验均需设阴性(双蒸水)对照，通常亦需设阳性对照。阳性对照通常使用MMS,EMS,MMC,CP环磷酞胺)等。如使用非水溶剂，则亦需设溶剂对照。5操作步

6、骤5.1培养液和培养条件:含10%马血清和适量抗菌素的RPMI164。培养液(96孔板培养时使用含20%马血清的RPMI164。培养液),5%二氧化碳、37'C、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。5.2处理:取生长良好的细胞，调整密度为5X105/mL，按1%体积加人受试物，370C震摇处理3h。离心，弃上清液，用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2X105/mL.125GB15193.20-20035.3PEo(0天的平板接种效率)测定:取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板(每

7、孔加。.2mL，即平均1.6个细胞/孔)，每个剂量作1块~2块板，370C,5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养12天，计数每块平板有集落生长的孔数。5.4表达:步骤(1)所得细胞悬液作2天表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在106/mL以下。计算相对悬浮生长(RelativeSuspensionGrowth,RSG),5.5PEA(第二天的平板接种效率)测定:2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，按步骤(2)作梯度稀释并接种96孔板，培养12天后计数每块平板有集落生长的孔数。5.6TFT抗性突变频率(tk-MF)测定:2天表达培养结束后，取