细菌快速裂解方法研究

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1、细菌快速裂解方法研究　16S-23SrRNA基因是位于16SrRNA基因与23SrRNA基因之间的区间序列，具有较好的保守性和相对的可变性，被认为是细菌鉴定的合适部位〔1，2〕。我们认为能否快速有效地扩增该区间，聚合酶链反应(PCR)扩增前的标本处理是关键。故比较了3种裂解细菌的方法。　　一、材料与方法　　1.菌株、人类基因组DNA及病毒株革兰阳性6个菌种，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等共19株；革兰阴性21个菌种，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌等共40株。以上菌株由浙江省临床检验中心及结核病防治中心提供，保存于我院细菌室。人类基

2、因组DNA、新型隐球菌、巨细胞病毒由本院中心实验室提供。　　2.临床标本：1999年6月～2000年3月本院新生儿住院患儿，部分为普通病房住院患儿。败血症血标本42份，脑脊液标本6份。对照组15份，为本院新生儿病房非感染患儿康复期待出院者的血标本。　　3.16S-23SrRNA基因区间序列引物设计：在细菌的16SrRNA基因的3＇端及23SrRNA基因的5＇端的保守序列内，经计算机软件查阅自行设计引物。　　4.临床标本处理：血标本：0.5ml的肝素抗凝血置室温约10min以沉淀血细胞，在血清与血细胞的交界面（即白细胞层）吸取200μl，注入1.5

3、ml灭菌的Eppendorf管中。加入0.87%的NH4Cl1ml，摇匀，放入37℃水浴箱中。15min后，取出，1000r/min离心5min，去上清液，在沉淀物中加NH4Cl1ml，重复上述步骤2次。最后在沉淀物中加5%Chelex100缓冲液（含0.03%SDS，1%吐温20，1%NP40）200μl和蛋白酶K2μl（20mg/ml），56℃孵育60min后煮沸15min，稍加离心后，取上清液做PCR扩增。　　脑脊液标本：0.5ml～1ml脑脊液1000r/min离心1min，去上清液，在沉淀物中加5%Chelex100缓冲液200μl和蛋

4、白酶K2μl，56℃孵育60min后再煮沸15min，稍加离心后，取上清液做PCR扩增。　　二、结果　　1.Chelex100改良裂解法能裂解所研究的所有菌种，且扩增产物条带清晰，效果满意。用经典的酚氯仿抽提法扩增细菌，效果同Chelex100改良法，但步骤繁琐〔3〕。　　2.临床标本的裂解：42例新生儿败血症血培养15例阳性，血标本经改良Chelex100裂解，PCR扩增后27例阳性，其阳性率明显高于血培养，差异有显著性意义（P＜0.01）。血培养阳性的15例PCR检测均阳性，且检测结果与血培养一致。另1组单纯用水煮裂解，只有5份阳性。6份脑脊

5、液培养2例阳性，脑脊液PCR检测4例阳性，培养阳性的2例与PCR结果相符。15份对照组血标本血培养及PCR检测均阴性。　　3.敏感性及引物特异性试验：取潘尼变形杆菌标准菌株放入1ml的ddH2O中，用麦氏比浊法确定起始浓度为108CFU，用ddH2O1∶10定量稀释，浓度范围为2.5×104～2.5×10-3CFU，取2μl模板在50μl的PCR体系中扩增，检测扩增下限。Chelex100缓冲液裂解法得PCR的最小检出量为2.5CFU/ml。本对引物只能扩增细菌，与人基因组DNA、新型隐球菌、巨细胞病毒无交叉反应，说明本对引物扩增细菌16s-23

6、srRNA基因有较好的特异性。　　三、讨论　　本研究首次在Chelex100的基础上进行改良，加上其他一些试剂配成一种适合不同菌种（包括葡萄球菌在内）PCR扩增的裂解液。并发现用Chelex100改良法裂解细菌后所扩增的条带较明亮清晰，效果满意，可检测2.5CFU/ml的细菌，敏感性比水煮法提高了100倍。用经典的酚/氯仿抽提细菌DNA再行PCR扩增，效果与Chelex100改良法相同。但经典的方法步骤较繁琐，DNA经常从1管转移到另1管，且还要使用多种试剂，这都增加了PCR污染的可能性。故Chelex100改良裂解法是一简便有效的方法，适合于不

7、同菌株的扩增。　　总之，经标准菌株和临床标本的初步应用，证明本研究建立的用Chelex100改良法一步扩增细菌的16S-23SrRNA基因区间具有准确、敏感、简便、快速的特点，若经大量临床标本的进一步证实，可成为一理想的诊断技术。