临床常见细菌和真菌快速检测方法的初步研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文临床常见细菌和真菌快速检测方法的初步研究Preliminarystudiesontherapiddetectionofclinicalcommonbacteriaandfungi课题来源：自选课题专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员临床检验诊断学韩慧吴炳义教授吴晓蔓教授李林教授温旺荣教授郑卫东主任技师曾方银主任技师论文评阅人芮勇宇教授贾卫华教授2012年5月10日广州I删渊硕士学位论丈一临床常见细菌和真菌快速检测方法的初步研究硕士研究生：韩慧指导教师：吴炳义教授摘要细

2、菌和真菌感染是临床常见的感染性疾病，发病率和死亡率高，如果得不到早期的诊断和治疗，会严重危及患者的生命。传统的培养法、生物化学检测和免疫学检测等方法，缺乏敏感性和特异性，不能早期快速的诊断病原茵感染，因此，寻找快速的诊断方法至关重要。在本研究中，我们建立了分子生物学方法，用于临床感染中常见细菌和真菌的快速诊断，指导临床合理应用抗生素。第一部分荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的建立目的：建立同时检测和鉴别革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌的TaqMan探针法荧光定量PCR，早期快速的诊断致病菌感染。方法：在GenBan

3、k数据库中查找20种细菌的16SrRNA基因序列和7种真菌的18SrRNA基因序列，应用ClustalX软件比对序列，找出各自的保守序列。使用PrimerExpress2．0和Oligo6．0软件，按照引物和探针设计的一般原则，在细菌的保守区筛选出细菌的通用引物和革兰分型探针，在真菌的保守区筛选真菌的通用引物和通用探针。革兰阳性探针和真菌探针的5’端标记荧光报告集团FAM，革兰阴性探针的5’端标记荧光报告集团HEX，它们的3’端均标记TAMRA荧光淬灭基团。细菌的扩增片段长度为229bp，真菌的扩增片段长度为276bp

4、，引物和探针均在Invitrogen公司合成。优化荧光定量PCR反应体系，细菌的两个分型探针在同一个管中，真菌的探针在单独的管中，即同一个模板进行细菌和真菌的中文摘要平行反应，每次反应均设置阳性对照、阴性对照和无模板的空白对照，所有反应均在ABI7500荧光定量PCR仪器上进行。检测11种革兰阳性细菌、9种革兰阴性细菌和7种真菌的标准菌株或者临床分离菌株，同时检测乙肝病毒DNA和人的基因组DNA，以观察所建立方法的特异性。使用标准菌株金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌、白色念珠菌进行普通PCR，分别构建阳性克隆质粒，定量后进行

5、十倍的梯度稀释，调整质粒浓度为108copies／gl-100copies／I-Ll。按照建立的反应条件用通用引物和特异性的探针进行荧光定量PCR，每个浓度做3次重复，评价方法的敏感性和线性关系。同时选取白色念珠菌3个不同浓度的定量标准质粒，连续三天进行重复检测，每次做三个复孔，通过计算其CT值的变异系数进行重复性和稳定性的评价。结果：用所设计的引物和探针检测20种细菌和7种真菌，11种革兰阳性菌在革兰阳性探针通道均有扩增曲线，在革兰阴性探针和真菌探针通道均无扩增曲线，9种革兰阴性菌在革兰阳性探针和真菌探针通道无扩增曲

6、线，在革兰阴性探针通道有明显的扩增曲线。使用细菌菌株DNA、病毒DNA和人基因组DNA作为模板，加入真菌的通用引物和通用探针，检测结果均是阴性，真菌菌株仅能被真菌探针检测到，CT值从15．6到26．0，说明所设计的引物和探针均是特异性的。对构建的三种菌的质粒使用无菌去离子水进行十倍的梯度稀释，使用建立的方法进行检测，结果显示三种质粒在108～101copies范围内都有很好的线性关系。如果反应体系中仅加入细菌的两个探针，以CT值35为界限，最低可以检测出金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌10个拷贝的质粒DNA。如果三个探针同时

7、加入反应体系，最低可检测出102个拷贝的质粒DNA。真菌的107拷贝、105拷贝和103拷贝数的批问变异系数分别为2．47％、1．89％和2．28％，均小于5％，说明本实验建立的方法重复性和稳定性较好。结论：本研究建立的多重荧光定量PCR方法，在单个样本中可以同时检测和鉴别Il硕士学位论文细菌和真菌感染，敏感性高、特异性强，使用三个探针即可区分出革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌感染，可以快速应用于临床实验室诊断，为感染性疾病的早期诊断提供了重要依据。第二部分荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的临床应用目的：评价所建立

8、的荧光定量PCR方法检测临床标本的应用价值。方法：每份脑脊液标本的一部分进行3000rpm离心10分钟，上清接种肉汤增菌，沉淀接种于巧克力平板、血平板和真菌显色平板，在5％的C02培养箱中37。C培养过夜。临床怀疑隐球菌感染的标本同时进行墨汁染色，在检验科常规室同时进行脑脊液常规分析。提取137份脑脊液标本的DNA，用建立的荧光定