小鼠白介素17基因表达、纯化、活性鉴定及抗小鼠白介素17抗体制备

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1、安徽医科大学硕士学位论文小鼠白介素17基因的的表达、纯化、活性鉴定及抗小鼠白介素17抗体的制备研究生姓名王金萍指导老师邓松华沈际佳教授教授安徽医科大学合肥230032中文摘要目的通过基因工程技术获得有活性的重组小鼠白介素17(recombinantmouseInterleukin-17,rmIL-17)蛋白，检测验证rmIL-17的活性及免疫原性。同时用纯化的重组蛋白rmIL-17免疫小鼠及家兔，制备并鉴定抗rmIL-17蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，为进一步研究IL-17的生物学作用及其作用机制提供基础。方法用RT-PCR技术得到小鼠IL-17编码基因，将其克隆入原核

2、表达载体pET32a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,通过亲和层析制备纯化的rmIL-17蛋白，免疫家兔制备抗rmIL-17多克隆抗体并纯化多抗，用多抗做Western-blot和酶联免疫吸附实验鉴定该蛋白免疫原性；用rmIL-17蛋白进行体外小鼠成纤维细胞刺激实验，将小鼠3T3成纤维细胞调整密度为4×105/ml于24孔板中，分别加入rmIL-17蛋白至终浓度0.01,0.1,1,10,100,1000ng/ml，放入CO2孵箱中共孵育24小时，取上清，用鼠IL-6定量酶联检测试剂盒ELISA检测IL-6浓度

3、。同样条件下以1000ng/ml日本血吸虫29KD膜外重组蛋白为阴性对照，培养基为空白对照；用rmIL-17蛋白进行体内中性粒细胞招募实验，试验组用无菌的PBS稀释0.5µgrmIL-17蛋白至500µl，BALB/C小鼠腹腔内注射。腹腔注射等量日本血吸虫29KD膜外重组蛋白做对照组。0.5µgrmIL-17和10µg抗鼠IL-17中和抗体用无菌PBS稀释至500µl，37℃孵育15分钟2安徽医科大学硕士学位论文后，腹腔注射，作为中和组。4小时之后分别放血处死小鼠，打开腹腔用2.5ml含有3mMEDTA的PBS冲洗，收集洗出液，进行细胞总数计数和中性粒细胞染色计数；用rmIL-

4、17蛋白免疫小鼠6周后，将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行杂交融合，HAT筛选出杂交瘤细胞，经亚克隆及扩大培养，建立抗rmIL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用间接ELISA法检测杂交瘤上清。Western-Blotting实验鉴定单克隆抗体的免疫学特性。结果成功构建了重组质粒pET32a-mIL17并在大肠杆菌中表达。过柱得到纯化的rmIL-17蛋白，制备了抗rmIL-17多克隆抗体Western-blot实验证实其具有良好的免疫原性；体外细胞刺激实验显示该蛋白可刺激小鼠3T3成纤维细胞产生白介素6(Interleukin-6,IL-6)且具有量效关系;随着加入的rmIL

5、-17蛋白浓度的升高，小鼠3T3成纤维细胞分泌IL-6的量也随之升高；体内细胞招募实验显示纯化的rmIL-17蛋白具有招募中性粒细胞的作用。以日本血吸虫29KD膜外重组蛋白为对照组，以抗鼠IL-17中和抗体中和组，对照组(0.481±0.154)×106与实验组(4.27±1.10)×106差异具有显著性(P<0.05)，中和组(2.01±0.90)×106与实验组(4.27±1.10)×106差异也有显著性(P<0.05)，证实了rmIL-17的体外活性；制备两株抗rmIL-17单克隆抗体，单抗亚型分别为IgG1,IgG2a；Western-Blotting结果证实了该2株单

6、克隆抗体的免疫学特性。结论小鼠IL-17基因在体外成功表达，且表达的重组蛋白具有明显的生物学活性。rmIL-17多克隆抗体和单克隆抗体的制备为我们下一步的实验奠定了的基础。关键词rmIL-17；原核表达；生物学活性；单克隆抗体。3安徽医科大学硕士学位论文Expression,Purification,andIdentificationofMouseInterleukin-17andPreparationofAnti-mouseIL-17AntibodyPostgraduateGraduateadviserWangjinpingProDengsonghuaProShenjij

7、iaAbstractObjective:ThroughgeneticengineeringtechniquesobtaintheactiverecombinantmouseIL-17(recombinantmouseInterleukin-17,rmIL-17)proteintodetecttheactivityofrmIL-17certificationandimmunogenicity.AtthesametimewiththepurifiedrecombinantproteinrmIL-