通络益智散对拟血管性痴呆大鼠脑组织中glu和gaba影响的实验研究论文

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1、通络益智散对拟血管性痴呆大鼠脑组织中Glu和GABA影响的实验研究论文.freelentia,VD)是由各种脑血管病所导致的痴呆综合征。属于中医“呆病”、“文痴”、“健忘”等范畴。在我国由于脑血管病的多发,使得VD成为高发疾病之一。目前国内外对控制本病病程进展尚无有效方法和药物，但根据现在的研究结论认为VD具有潜在的可防治性，其部分是可逆的1。本研究通过观察通络益智散对拟血管性痴呆大鼠GABA表达及Glu含量的影响，进一步阐明通络益智散对血管性痴呆的作用机制.freelg/支）用双蒸水配成1mg/L溶液，黑纸包裹备用；尼莫地平(山

2、西亚宝药业集团有限公司生产，批号041003，20mg/片，实验时用生理盐水配成1mg/mL的混悬液)；通络益智散由红芪、当归、地龙、红花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、远志组成，将其水煎3次，合并浓缩为含生药3.14g/mL的药液，高压灭菌，4℃贮存备用。Glu及总蛋白测试盒购自南京建成生物工程研究所，批号为20041207；SABC试剂盒和兔抗大鼠GABA由武汉博士德生物工程有限公司生产。1.3仪器HANGPING电子称:上海精科公司天平仪器厂生产，型号JY4001；可控低温冰箱:青岛澳柯玛，型号BCD-183；H.H.S21-

3、4电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂生产；VIS-7220紫外分光光度计，北京第二光学仪器厂生产；LXJ-64-01高速光学仪器离心机，北京医疗仪器修理厂生产。2实验方法2.1模型制备采用王蕊等2的改进方法，将大鼠用3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉（moncaroAidarAeris，CCA），在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射硝普钠（2.5mg/kg），随即用无创伤动脉夹夹闭双侧CCA10min，共夹闭2次，每次间隔10min，即采用2次缺血10min、再灌10mi

4、n的方式。再通后伤口滴青霉素适量，缝合伤口，放回笼中，(27±0.5)℃温度下饲养。在全部造模过程中用肛表密切测量大鼠肛温，保持肛温在37℃左右，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。2.2动物分组及处理从60只大鼠中随机选出10只作为假手术组，假手术组只进行麻醉，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，但不阻断CCA及腹腔注射硝普钠。其余50只造模，手术过程由于损伤喉返神经、出血过多、麻醉过量，死亡6只大鼠，术后两天相继死亡4只，余40只大鼠随机分为模型组、通络益智散大剂量组、通络益智散小剂量组、尼莫地平对照组，每组10只。所有大鼠从造模后第

5、7d开始给药，1日1次。假手术组与模型组予生理盐水；通络益智散大剂量相当于正常成人用量的20倍（浓度为3.14g/mL）；通络益智散小剂量相当于正常成人用量的5倍（浓度为0.785g/mL）；尼莫地平组给予尼莫地平悬浊液（相当于正常成人用量的20倍），给药剂量均为0.01mL/g，连续给药21d。2.3标本采集和处理治疗结束后第28d，迅速开胸暴露心脏，从左心室插入导管至主动脉，于右心耳部剪一小口，用生理盐水快速冲洗，直到右心房流出液清亮为止。洗毕将大鼠快速断头取脑，在冰盘上去除脑膜和血管，分离海马称重，放入玻璃匀浆器加9倍生理盐

6、水，在冰浴中匀浆，3000r/min离心机离心10min，取上清液予－20℃冰箱内冻存待测。右半脑置于4%多聚甲醛及0.1mol/L磷酸缓冲液中固定72h后，取海马常规脱水，石蜡包埋，冠状连续切片（4μm），40℃水温展片，明胶处理的载玻片捞片后置于60℃的烤箱内烤2～3h。2.4Glu的检测依据试剂盒说明书步骤，用7220分光光度计进行检测。2.5GABA的检测（1）对石蜡切片进行免疫组织化学反应。①脱蜡。②滴加0.03%H2O2的甲醇溶液(室温)30min以去除内源性过氧化物酶，然后蒸馏水洗3次。③热源修复抗原：将切片浸入0.

7、01mol/L的枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10min，反复1～2次，冷却后用PBS(pH7.2～7.6)洗涤1～2次。④用抗原修复液Ⅰ进一步暴露抗原：将抗原（稀释1∶200）修复液滴加在切片上,室温10min后，用PBS(pH7.2～7.6)洗涤3次。⑤在切片上滴加封闭液，室温20min，甩去多余的液体，不能冲洗。⑥滴加稀释的一抗兔IgG，放入冷藏室过夜。第二天取出切片，放置至室温后，用PBS(pH7.2～7.6)洗涤3次，各2min。⑦再滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃温度下放置20m

8、in，用PBS(pH7.2～7.6)洗涤3次，各2min。⑧滴加试剂SABC，在20～37℃温度下放置20min，用PBS(pH7.2～7.6)洗涤3次，各5min。⑨DBA显色：使用DBA显色试剂盒（AR1022），取1mL蒸馏水加试剂盒中A、B