砷暴露小鼠肝组织核酸损伤免疫组织化学观察

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1、砷暴露小鼠肝组织核酸损伤免疫组织化学观察李秋娟，杨光，叶建新，孙鲜策，陈敏，刘晓芳，朴丰源【关键词】砷；肝；8　　摘要：目的为进一步研究砷对肝脏的毒性作用机制提供实验依据。方法昆明种小鼠40只，随机分为4组：1,2,4mg/L三氧化二砷染毒组和生理盐水组，连续染毒60d，取小鼠肝组织固定，用免疫组化方法观察肝脏组织细胞的8Nitroguanine表达。结果染砷组小鼠肝细胞出现抗8Nitroguanine免疫染色阳性反应，并随着砷暴露剂量的增加而呈现明显的剂量-反应关系。结论慢性低剂量砷暴露可诱发小鼠肝细胞8Nitroguanine的高表达，提示8硝基鸟嘌呤核苷(8Nitr

2、oguanine)可以作为砷对肝细胞毒性作用的早期敏感生物标志物。　　关键词：砷；肝；8Nitroguanine；免疫组化；核酸损伤　　Observationonnucleicaciddamageofliverinmiceexposedtoarsenicinlomunohistochemistry　　DepartmentofHygiene,DalianMedicalUniversity(Dalian116027,China)Abstract：ObjectiveToprovideevidenceforexploringthemechanismofarsenicinduced

3、hepatoxicity.MethodsFortymiceentalgroups(1mg/LAs2O3,2mg/LAs2O3and4mg/LAS2O3).As2O3inisteredfor60days.Immunohistochemistrymethodice.ResultsExpressionof8Nitroguanineiceexposedtoarsenicandthereice.8Nitroguaninemightbeanearliersensitivebio-markerforarsenictoxicitytoliver.　　Keymunohistochemist

4、ry；nucleicacid　　近年来，动物实验和人群流行病学调查均表明，砷可引起不同程度的肝损伤、肝纤维化、肝硬化及肝癌〔1-3〕。研究表明，砷可影响体内氧化还原平衡，增高肝细胞脂质过氧化水平，降低谷胱甘肽(GSH)浓度和抗氧化酶活性，使肝组织受到自由基损害〔4，5〕。但是，其机制目前尚不十分清楚。本研究以小鼠为研究对象，以8Nitroguanine作为生物标志物，通过免疫组化方法，观察砷对肝组织细胞核酸的损伤作用，为探讨砷的肝脏组织毒性作用机制提供依据。　　1材料与方法　　11材料抗8-硝基鸟嘌呤单克隆抗体(日本岛津公司)；UltraSensitiveTMSP超敏试剂

5、盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司）；其他试剂均为分析纯。　　12方法　　121动物处理成熟健康昆明种小鼠40只，雌雄各半(大连医科大学实验动物中心)。按体重随机分为4组：1,2,4mg/L的三氧化二砷(As2O3)染毒组和生理盐水对照组。小鼠通过自然饮用含As2O3自来水方式染毒，每天测定水消耗量。连续染毒60d后，断头处死并立即取肝组织固定。　　122肝组织形态学观察(图1)肝组织经福尔马林固定后，常规石蜡包埋，5μm连续切片，在65℃温箱中烤片60min；苏木素伊红(HE)染色，光镜下进行组织形态学观察。　　123肝组织免疫组织化学观

6、察按照免疫组化染色法(SP)〔5〕，在肝组织切片上滴1∶300稀释的鼠抗人8Nitroguanine单克隆抗体，在4℃条件下孵育过夜，然后按UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒的步骤进行，经二氨基联苯胺(DAB)显色，HE复染细胞核，自来水冲洗返蓝。常规脱水、透明，中性树胶封片。阅片时，先观察整张切片，再随机选择不同区域的5个高倍视野，显微镜下拍照，并应用图象分析软件对8Nitroguanine表达的平均吸光度进行定量的分析(Imageproplus45)。　　13统计分析应用SPSS115软件进行统计分析。用Scheff'stest方法进行组间均数比较，以P0

7、05表示差异有统计学意义。　　2结果　　21肝组织病理学观察(图1)肝组织形态学观察结果，对照组肝细胞核膜完整，核仁清晰，胞浆正常(图1A)。而染砷组肝脏细胞肿胀，胞浆出现空泡状改变，细胞核固缩、碎裂或溶解，肝组织有明显的病理改变(图1B)。　　图1小鼠肝组织SP观察结果(HE，×200)（略）　　22肝组织细胞核酸损伤的免疫组织化学观察(图2)小鼠肝组织抗8Nitroguanine的免疫组化结果显示，染砷组小鼠肝组织细胞中靠近细胞膜的胞浆被染成棕褐色(图2B,C,D)，呈现明显的抗8Nitroguanine阳性反应，而对照组