基于肝损伤小鼠模型重构小鼠和人的肝脏

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文基于肝损伤小鼠模型重构小鼠和人的肝脏GenerationofthereconstructedmouseandhumanliverDaSed0nam0USemodel0lllVerlnlUrV■●1一●●●课题来源：国家自然科学基金委员会．广东省联合基金重点项目(编号：u0732006)国家自然科学基金(编号：81172587)广东省科教计划项目(编号：20098060300008)广东省自然科学基金项目(编号：9151063101000015)学位申请人樊全荣导师姓名姚开泰教授肖东研究员专业名称肿瘤学培养类型学术型培养层次硕士研究生所

2、在学院基础医学院2013年4月25日广州硕士学位论文IIIIIIlUllIIIY2406493基于肝损伤小鼠模型重构小鼠和人的肝脏硕士研究生樊全荣硕士生导师姚开泰教授指导老师肖东研究员摘要目前，肝病相关的体内研究多基于在小鼠的肝脏开展。然而，小鼠肝脏与人的存在差异，致使基于小鼠肝脏获得的许多研究结果不能直接应用到人体，而人的体内研究受伦理和技术等方面的制约。肝脏人源化的嵌合体(人鼠嵌合肝)小鼠是在人肝脏发育和再生机制、人类肝脏相关疾病(肝炎、肝硬化和肝癌等)发病机制、肝炎病毒(HBV和HCV等)易感动物模型建立、药物代谢动力学等领域具有重要的应用价值，其也为在大动物(

3、如小型猪)体内重构人肝脏提供理论依据和进行实践探索，并成为临床前研究由鼠到人之间的重要载体和桥梁。因此，制备高比率嵌合有人肝细胞的人．鼠嵌合肝对人类的肝病研究具有巨大而深远的意义。早期是将人肝细胞异位移植进小鼠体内建立人鼠嵌合肝，现在随着科学技术的不断进步，人们开始将目光转向利用干细胞来实现人和鼠肝脏的嵌合。干细胞(stemcells，sc)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，它是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。这就为干细胞在一定环境下发育成肝细胞提供了理论依据。同时也为在小鼠

4、体内建立人鼠嵌合肝模型提供了可能。截止到现在，国内外均有文献报道将干细胞通过核移植或宫内移植进正常动物体内，以实现多组织多器官的嵌合。但是，由于宿主体内的微环境中缺乏移植细胞生长的各种激素和生长因子，宿主细胞的增殖将优先于移植细胞，因此，各组织器官的嵌合率比较低。为了克服上述困难，得到高比率嵌合的个体，摘要选用特定器官缺陷的动物模型作为受体环境是较为理想的选择。富马酰乙酰乙酸盐水解酶(Fah)基因敲除小鼠缺乏Fah基因，酪氨酸分解代谢的最后一步受到阻碍，导致富马酰乙酰乙酸盐(FAA)和前体(MAA)底物的聚集，FAA与MAA对肝脏有毒性。利用此肝损伤小鼠模型作为受体动

5、物，将人干细胞移植进该鼠的囊胚中，有望提高人干细胞在宿主体内的增殖优势，这对研发人肝细胞高比率嵌合的嵌合肝模型是至关重要的。为实现灵敏的非损伤、实时和可视化体内示踪移植供体细胞及其在体内衍生的细胞，通过综合分析活体内生物发光[用荧光素酶(Luciferase，Luc)基因标记细胞等】成像和荧光[荧光报告基团(GFP和RFP等)】成像各自的特点和优势，为将生物发光成像和荧光成像的优点集为一身，我们将用双报告或三荧光报告基因标记供体移植细胞，已达到活体示踪的目的。在研究中，我们首先利用小鼠诱导性多潜能干细胞(Mouseinducedpluripotentstemcells

6、，miPSCs)通过囊胚腔移植(Blastocysttransplantation)建立鼠／鼠嵌合肝动物模型，待方法和技术成熟后再利用人骨髓间充质干细胞(Humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hMSCs)通过囊胚腔移植建立人／／J、鼠嵌合肝动物模型。第一部分小鼠诱导性多潜能干细胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠／鼠嵌合肝动物模型目的：通过小鼠诱导性多潜能干细胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠／鼠嵌合肝动物模型，一方面可以观察干细胞在体内对受损肝脏的修复作用，另一方面为建立人／鼠嵌合肝模型提供理论和实践基础。材料和方法：(1)慢病毒载体

7、pEFla-ZsGreen．Fluc鉴定，慢病毒生产与鉴定，慢病毒感染miPSCs；(2)检测病毒感染后的miPSCs(LG．miPSCs)是否仍然保持其干性；(3)硕士学位论文鼠／鼠嵌合体动物的制作将携带有绿色荧光蛋白(ZsGreen)和荧光素酶(Fluc)双报告基因的miPSCs移植进Fah(．／．)小鼠的囊胚中，然后将囊胚移植进假孕母鼠的子宫内，待其出生；(4)体式荧光显微镜检测待小鼠出生后3天在镜下观察是否可以看到绿色荧光，待小鼠成年后取材，取其肝脏、肾脏、心脏、脑、肺脏、脾脏等脏器在镜下观察是否可见绿色荧光；(5)小动物活体成像仪检测小鼠从