砷暴露小鼠肝组织核酸损伤免疫组织化学观察论文

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1、砷暴露小鼠肝组织核酸损伤免疫组织化学观察论文李秋娟，杨光，叶建新，孙鲜策，陈敏，刘晓芳，朴丰源【关键词】砷；肝；8摘要：目的为进一步研究砷对肝脏的毒性作用机制提供实验依据。方法昆明种小鼠40只，随机分为4组：1,2,4mg/L三氧化二砷染毒组和生理盐水组.freelageofliverinmiceexposedtoarsenicinlomunohistochemistryDepartmentofHygiene,DalianMedicalUniversity(Dalian116027,China)Abstract：ObjectiveToprovideevidenceforexp

2、loringthemechanismofarsenicinducedhepatoxicity.MethodsFortymiceentalgroups(1mg/LAs2O3,2mg/LAs2O3and4mg/LAS2O3).As2O3inisteredfor60days.Immunohistochemistrymethodice.ResultsExpressionof8Nitroguanineiceexposedtoarsenicandthereice.8Nitroguaninemightbeanearliersensitivebio-markerforarsenictoxic

3、itytoliver.Keymunohistochemistry；nucleicacid近年来，动物实验和人群流行病学调查均表明，砷可引起不同程度的肝损伤、肝纤维化、肝硬化及肝癌〔1-3〕。研究表明，砷可影响体内氧化还原平衡，增高肝细胞脂质过氧化水平，降低谷胱甘肽(GSH)浓度和抗氧化酶活性，使肝组织受到自由基损害〔4，5〕。但是，其机制目前尚不十分清楚。本研究以小鼠为研究对象，以8Nitroguanine作为生物标志物，通过免疫组化方法，观察砷对肝组织细胞核酸的损伤作用，为探讨砷的肝脏组织毒性作用机制提供依据。1材料与方法11材料抗8-硝基鸟嘌呤单克隆抗体(日本岛津公司)；

4、UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司）；其他试剂均为分析纯。12方法121动物处理成熟健康昆明种小鼠40只，雌雄各半(大连医科大学实验动物中心)。按体重随机分为4组：1,2,4mg/L的三氧化二砷(As2O3)染毒组和生理盐水对照组。小鼠通过自然饮用含As2O3自来水方式染毒，每天测定水消耗量。连续染毒60d后，断头处死并立即取肝组织固定。122肝组织形态学观察(图1)肝组织经福尔马林固定后，常规石蜡包埋，5μm连续切片，在65℃温箱中烤片60min；苏木素伊红(HE)染色，光镜下进行组织形态学观察。1

5、23肝组织免疫组织化学观察按照免疫组化染色法(SP)〔5〕，在肝组织切片上滴1∶300稀释的鼠抗人8Nitroguanine单克隆抗体，在4℃条件下孵育过夜，然后按UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒的步骤进行，经二氨基联苯胺(DAB)显色，HE复染细胞核，自来水冲洗返蓝。常规脱水、透明，中性树胶封片。阅片时，先观察整张切片，再随机选择不同区域的5个高倍视野，显微镜下拍照，并应用图象分析软件对8Nitroguanine表达的平均吸光度进行定量的分析(Imageproplus45)。13统计分析应用SPSS115软件进行统计分析。用Scheff'stest方法进行组间

6、均数比较，以P005表示差异有统计学意义。2结果21肝组织病理学观察(图1)肝组织形态学观察结果，对照组肝细胞核膜完整，核仁清晰，胞浆正常(图1A)。而染砷组肝脏细胞肿胀，胞浆出现空泡状改变，细胞核固缩、碎裂或溶解，肝组织有明显的病理改变(图1B)。图1小鼠肝组织SP观察结果(HE，×200)（略）22肝组织细胞核酸损伤的免疫组织化学观察(图2)小鼠肝组织抗8Nitroguanine的免疫组化结果显示，染砷组小鼠肝组织细胞中靠近细胞膜的胞浆被染成棕褐色(图2B,C,D)，呈现明显的抗8Nitroguanine阳性反应，而对照组小鼠肝组织细胞中几乎无8Nitroguanine的

7、表达(图2A)。各组小鼠肝细胞的抗8Nitroguanine免疫染色用平均吸光度值表示，低、中、高3个实验组的平均吸光度值分别为(0029±0014)，(0042±0016)和(0257±0155)，明显大于对照组(0003±0002)，差异有统计学意义(P005或P001)，并随着砷暴露剂量的增加而呈现明显的剂量反应关系。图2小鼠肝组织抗8Nitroguanine组织化学染色结果(HE，×200)（略）3讨论以往的动物实验表明，砷可在大鼠肝组织中蓄积，慢性砷暴露大鼠肝组织的砷含量与暴露浓度呈正相关〔6