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《生物起搏种子细胞筛选及hcn通道电药理学实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究报告人：杨靖导师：黄从新教授研究背景缓慢性心律失常为临床常见多发病电子起搏器植入术是治疗严重缓慢性心律失常的首选方案电子起搏器存在缺陷非生理性起搏电池寿命有限易受外界电磁干扰等生物起搏器构建--当前研究热点主要内容生物起搏器种子细胞筛选HCN通道电生理及药理学实验研究第一部分生物起搏器种子细胞筛选研究对象心脏干细胞（CSCs）脂肪干细胞（ASCs）骨髓间充质干细胞（BMSCs）CSCs的相关研究研究内容CSCs的分离培养及其鉴定5-氮杂胞苷诱导CSCs向窦房结样细胞分化实验方法小园形、亮的细胞从组织移植块中爬
2、出（箭头所示）（×200）流式细胞仪分选左图，分选前流式细胞仪检测培养细胞c-kit阳性率右图，用流式细胞仪分选经c-kit标记的细胞流式细胞仪检测流式细胞仪鉴定分选后CD34、CD45的阳性率倒置显微镜观察分选后的单个细胞（左图），培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成（右图）（×200）荧光显微镜观察在光学显微镜下(左图)、荧光显微镜下（右图）观察刚分选的同一批c-kit+细胞（×400）增殖能力比较不同部位间比较增殖能力比较不同性别间比较免疫荧光检测分选后4周用抗cTnI,SMAandCD31抗体检测培养细胞免疫表型（A,×300;B-C,×200）AC
3、BRT-PCR检测RT-PCR检测RT-PCR方法分析分选细胞不同培养时间的GATA-4,HCN2和HCN4的mRNA表达*P<0.05,#P<0.01,培养8周组vs培养4周组免疫荧光检测5-Aza诱导CSCs分化用抗cTnI,GATA4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化的免疫表型（A,×200;B,×400）免疫荧光检测用抗HCN4抗体检测经5-Aza诱导后CSCs分化细胞表达HCN4蛋白情况（A,×400;B,×200）荧光检测结果比较不同浓度5-aza诱导后的细胞在4周时表达GATA-4,cTnI和HCN4蛋白情况.10uM组与前两组比较，#P
4、<0.055-Aza诱导浓度RT-PCR检测RT-PCR技术分析在不同浓度5-aza诱导后的细胞在不同培养时间的GATA-4,HCN2和HCN4mRNA表达RT-PCR检测RT-PCR技术分析在不同浓度5-aza诱导后的培养细胞在不同培养时间的GATA-4,HCN2和HCN4mRNA表达.ΔP<0.05,#P<0.01,2组vs3组或4组结论体外培养条件下可以获得c-kit+CD34-CD45-CSCs不同部位不同性别来源CSCs的增殖能力存在差异c-kit+CSCs具有向心肌样和窦房结样细胞分化的能力10µM5-Aza有增强上述分化的作用ASCs与BMS
5、Cs相关研究实验流程ASCsBMSCs细胞形态学流式细胞仪检测细胞表面标记物增殖能力比较5-AZa诱导cTnI阳性率比较HCN4mRNA相对含量检测倒置显微镜观察、拍照CD29、CD44CD73、CD14CD34转染HCN4基因CCK-8试剂盒转染效率凋亡率形态学比较（P5）(×200)ASCsBMSCs表面标记物检测（P5）抗原表达水平无显著差异增殖能力比较*P<0.05**P<0.01ASCs体外扩增能力强于BMSCs且P15仍保持较高的增殖能力ASCs和BMSCs向心肌细胞分化能力比较（P5）(×400)犬ASCs心肌样分化能力强于BMSCsaASC
6、sbBMSCsc两者对比RT-PCR检测加入5-AZa后ASCs与BMSCsHCN4mRNA的表达aASCsbBMSCsc两者对比各个时间点ASCs中HCN4mRNA表达量均高于BMSCsASCs和BMSCs转染HCN4效率比较（×400）aASCsbBMSCsc两者对比P5代ASCs与BMSCs转染效率无显著统计学差异P>0.05（×400）ASCs和BMSCs转染HCN4后凋亡率比较aASCsbBMSCsc两者对比P5代ASCs转染HCN基因后凋亡率低于BMSCsP<0.05结论来自同一个体的ASCs与BMSCs相比具有更强的体外增殖能力具有更强的向心
7、肌样细胞及窦房结样细胞分化的能力二者基因转染效率相似，但转染HCN4基因后ASCs凋亡水平更低第二部分HCN通道电生理及药理学实验研究主要内容HCN通道在卵母细胞中的表达HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs胺碘酮对HCN通道的作用及机制HCN通道在卵母细胞中的表达爪蟾卵母细胞HCN通道基因分离扩增、酶切、线性化培养体外转录细胞内显微注射通道表达卵母细胞钳记录通道电流实验流程电生理学指标电流表达幅值通道动力学特性HCN通道电流A.HCN1电流B.HCN2电流C.HCN4电流D.激活曲线HCN通道动力学A.典型电流B.I-V曲线C.去激活常数D.激活常数H
8、CN1/HCN2共表达形成的电流幅值HCN1/HCN4共表达形成的
