HCN4基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心脏起搏样细胞的电生理研究

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1、第三军医大学博士学位论文HCN4基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心脏起搏样细胞的电生理研究姓名：王泽文申请学位级别：博士专业：内科学（心血管病）指导教师：宋治远20070501第三军医大学博士学位论文HCN4基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心脏起搏样细胞的电生理研究摘要研究背景：病态窦房结综合征临床常见，对人类健康危害极大，但目前其发病机理尚不十分明确，也无有效的防治措施，其主要方法是安置心脏起搏器，病人既要承受手术痛苦，承担昂贵的医疗费用，又必须面对起搏器安置所带来的各种风险，而从心脏的生理功能及人体的适应性而言，植入

2、电子心脏起搏器也并非最理想的治疗选择。因此，探讨新的治疗方法，以取代传统的心脏起搏治疗已成为电生理学界当前研究的热点内容之一。近年来，随着干细胞基础与应用研究的逐渐深入，干细胞移植引起的心肌再生已成为心血管领域研究的热点。初步研究结果显示，干细胞移植用于急性心肌梗死、晚期冠心病及慢性心力衰竭患者，有改善心肌灌注和／或心肌收缩的潜能。Shake等将骨髓间充质干细胞(MSCs)移植至猪心肌梗死模型的心肌，结果发现，经MSCs治疗的猪死亡率降低60％、梗死面积缩小40％、血流动力学得到明显改善。干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展，不仅为治疗

3、终末期缺血性心脏病提供了全新的策略，也为开展其他心脏疾病细胞再生治疗研究提供了新的思路。病窦综合征的发生虽与心肌细胞急性一r缺血性损伤无直接因果关系，但此病患者窦房结细胞被非炎症性退化毁损及细胞凋亡现象的存在早已被尸解资料所证实。因此，将干细胞移植至患者窦房结区域，使之定向分化为窦房结起搏细胞，重建病窦综合征患者窦房结的结构与功能，将有望使本病得到根治。研究目的：本课题组在国家自然科学基金(30370585)的资助下进行了小鼠HCN4基因转染及体外诱导分化心脏起搏样细胞的研究，获得了稳定表达HCN4的鼠MSCs，并在体外诱导获得了能

4、产生自主搏动的心脏起搏样细胞。但体外诱导培养获得的心脏起搏样细胞是否具有类似窦房结细胞的生理功能?尚不清楚。本研究目的旨在探讨HCN4基因修饰大鼠MSCs诱导分化的心脏起搏样细胞的电生理特性，为进一步开展生物心脏起搏治疗研究奠定实验基础。6第三军医大学博士学位论文研究方法：1．以HCN4基因修饰大鼠MSCs体外诱导获得的具有自发搏动的心脏起搏样细胞为实验组，同期培养的原代乳鼠窦房结细胞等为对照组。2．采用全细胞膜片钳技术对心脏起搏样细胞和乳鼠窦房结细胞的动作电位、起搏离子流(10、钾电流、L．型钙电流进行检测。3．采用蛋白免疫印迹(

5、Westernblot)检测心脏起搏样细胞L一型钙通道otlc的表达，用quantityone软件进行图像分析，用平均光密度值(L一型钙通道etlc光密度值／p—actin的光密度值)表示蛋白相对含量。并与原代培养的乳鼠窦房结细胞和大鼠MSCs进行比较。4．采用激光共聚焦扫描显微镜检测其细胞内游离钙荧光强度，并与原代培养的乳鼠窦房结细胞和大鼠MSCs进行比较。结果1．采用全细胞膜片钳技术对心脏起搏样细胞及原代培养乳鼠窦房结细胞进行检测，均可记录到具有舒张期自动除极化的动作电位，心脏起搏样细胞的动作电位特性与原代培养的乳鼠窦房结细胞相

6、比，其静息电位、动作电位幅度及动作电位周期均无显著性差异(．50_+2．8mVVS．55±5．5mV，一60+2．5mVvs．65±2．5mV，240_57msVS250_60ms)，但t域电位较对照组显著降低(．30±2．5mVVS一55±5．5mV，p<0．01)。2．采用全细胞膜片钳技术对心脏起搏样细胞进行检测，均可记录到起搏离子流(If)，结果发现，心脏起搏样细胞If的特点是具有超级化超级化激活、被CsCl特异性阻断，其内向电流幅度随超级化电位加大而增加，当钳制电压转为+20mV时，内向电流即停止，随即出现方向相反的尾电流。

7、其特征与同期培养的原代乳鼠窦房结细胞相似。3．采用全细胞膜片钳技术对心脏起搏样细胞进行检测，可检测到三种不同外向钾电流，分别为瞬间外向钾电流(I。。)、超快速激活延迟整流钾电流(Ik。，)和缓慢激活延迟整流钾电流(Ik。)。I。。特点为快速激活、快速失活，Ik。，特点为快速激活、长时开放，对4一AP较敏感，Ik。特点为缓慢激活、长时开放，对4-AP不敏感，而对TEA敏感。在不同钳制电压下，与对照组相比，仅Ik。的电流幅度均值较对照组明显偏低(尸<0．01)，而It。及Ik。，无显著性差异。4．采用全细胞膜片钳技术对心脏起搏样细胞L一

8、型钙电流进行检测，结果发现，心第三军医大学博士学位论文脏起搏样细胞L一型钙电流的激活电位、反转电位和电流最大幅值与对照组比较均无显著性差异(一40±1．5mVVS一40±2．5mV，一32±2．1mVVS．35±2．4mV，一0．94