tbx1基因与心脏圆锥干畸形致病基因的关系探索

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1、Tbx1基因与心脏圆锥干畸形致病基因的关系探索-->Tbx1基因与心脏圆锥干畸形致病基因的关系探索【摘要】　目的　检测心脏圆锥干畸形Tbx1基因杂合性缺失情况。方法　以Tbx1基因部分片段为探针,用分子细胞遗传学的荧光原位杂交技术检测了22例心脏圆锥干畸形患者,其中综合征型5例,孤立型17例。结果　5例综合征型患者中有2例存在22q11·2位点上的Tbx1基因的杂合性缺失,其余患者中无此现象。另外,Northern杂交表明人Tbx1基因在胎心、胎肾以及成人的睾丸、骨骼肌中表达。结论　Tbx1基因

2、可能为上述综合征中某一发育异常的致病基因,与心脏圆锥干畸形致病基因的关系有待于无杂合性缺失患者的突变检测。[关键词]　　心脏缺失先天性Tbx1基因基因缺失杂合子【Abstract】　Objective　ThisresearchistoassesstheheterozygosityofTbx1geneon22q11·2inthepatientsalforma-tion.Methods　Byfluorescenceinsituhybridization(FISH)entofTbx1gene,ined

3、22patientsal-formationincluding5syndromiccasesand17isolatedcases.Northernblotedantissues.Results　Ticpatientshadchromosome22q11·2hemizygotemicrodeletionoftheTbx1gene,uscle,testis,lungandfetalheart.Conclusions　OurstudysuggeststhatTbx1genemaybeoneofthep

4、athogenicgenerelatedtoCATCH22.AssociationoftheTbx1geneandconotruncalheartteratogenicgeneistobefurtherde-tectedingenemutationofpatientsation,MIM编号217095)是一类较常见的先天性心脏病,占先天性心脏病的1/4~1/3[1]。有证据表明心脏圆锥干畸形为常染色体隐性遗传[2,3],22q11·2的微小的杂合性缺失被认为与该疾病发生有关。本研究拟用FISH方

5、法筛选出无22q11·2杂合性缺失的孤立型心脏圆锥干畸形患者,排除大片DNA缺失所引起的复杂基因背景,为Tbx1基因的突变检测提供研究对象,有望从分子水平初步阐明心脏圆锥干畸形的发病机制。1　资料和方法1·1　临床资料　心脏圆锥干畸形患者23人,其中孤立型17人,均为单纯心脏畸形;综合征型6人,均为心脏畸形合并面部异常:塌鼻梁、宽眼距、眼睑浮肿、小耳廓伴鼻音。G带检查发现1例患者为21三体,不在本研究范畴之内。其余5例患者中法乐氏四联症3例(60%),单心室1例(20%),法乐氏三联症1例(20

6、%);孤立型17例患者中法乐氏四联症15例(88%)、右室双出口1例(6%)、大动脉转位1例(6%)。患者年龄为4~24岁,其中男14人,女9人。1·2　外周血淋巴细胞培养及染色体制备　取肝素抗凝人外周血0·2ml接种于8ml含有20%胎牛血清和PHA的1640培养基中,37℃培养72h,收获前1·5h加秋水仙素,离心,收获细胞,低渗处理10~15min,固定2次,选分裂相多,染色体形态好,分散者滴片,烤干后梯度乙醇脱水,-70℃保存。1·3　探针构建　该探针为Tbx1基因第4号外显子序列,以引

7、物Tbxaf,Tbxad(TGCCTTCCACCAGCTAGG,AGACGACCCTTG-GAGTTGG,Tm=62℃),正常人基因组DNA为模板PCR获得。PCR产物6%聚丙烯酰胺凝胶电泳回收,测序证实为目的DNA后,[α-32P]-dATPPCR法标记。1·4　Northern杂交　HumanRNAMasterBlot,包括胸腺、睾丸、胰腺、胎肾、肺、胎心、骨髓、肝脏、脾、前叶皮质、白细胞、胎盘、骨骼肌、胎肝、垂体、大脑、胎脑等50种组织RNA与上述探针杂交6h,洗膜压片,-70℃曝光24h

8、,显影定影。1·5　基因组DNA文库筛选　基因组DNA文库载体为λDASH,克隆位点为EcoRI,宿主菌为LE392。与已标记寡核苷酸探针杂交17h,洗膜压片,-70℃曝光24h,显影定影。对膜后得到阳性克隆,按上述步骤复筛,得到单克隆,挑出单克隆行固相培养,QIAGENtip100按LambdaDNAKit操作程序抽取纯化λ噬菌体DNA,行EcorRI酶切反应。0·8%琼脂糖凝胶电泳检测产物大小;以Tbxaf,Tbxad为引物,行PCR反应,产物回收后测序。1·6　FISH　按NickTran