不同肢端畸形中基因突变鉴定及致病机制研究

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1、·中文论著摘要·不同肢端畸形中基因突变鉴定及致病机制研究刖舌先天性肢端畸形是人类最常见的出生缺陷之一，不仅影响肢体的外观形态和功能运动，甚至使患者丧失劳动和生活能力。近年来，随着人类基因组计划的完成，人类单基因遗传病致病基因鉴定不断取得进展，各种四肢先天畸形的致病基因也逐渐被发现，人类先天性肢端畸形研究的数据不仅将补充以往动物和细胞实验的不足，还可以加深对胚胎发育过程的理解，而且可以为人类组织工程学研究和基因治疗药物的研制提供强有力的理论依据，因此对肢端畸形的致病基因突变鉴定及致病机制研究至关重要。引起先

2、天性肢端畸形的原因有环境因素和遗传因素两大类。遗传因素主要指基因突变或染色体畸变，其导致的肢端畸形既可单独发生又可是某种综合征的⋯部分。多种基因突变和染色体畸变都会直接引起肢端形态发生(morphogenesis)的异常，表现不同类型的肢端畸形，如短指(趾)(brachydactyly，BD)、缺指(趾)(ectrodactyly，ED)、多指(趾)(polydactyly，PD)和并指(趾)(syndactyly，SD)畸形等。近端指(趾)间关节粘连(proximalsymphalangism，SYMl

3、，MIM185800)以肢端骨骼融合和短指(趾)为主要表型，常被认为是BDC(BrachydactylytypeC，MIM113100)的一部分。SYMl为常染色体显性遗传，致病基因是GDF5(growth／differentiationfactor5．MIM601146)或NOG(MIM602991)。缺指(趾)／手足裂畸形(ectrodactyly／split—hand／split—footmalformation，SHFM)是四肢端骨(autopod)中部指轴发育不全而剩余指(趾)呈不同模式融合导致

4、严重影响患者精细活动的先天性肢端畸形，典型表现为龙虾爪(中部指轴缺陷)或独指(桡侧指轴缺陷而无裂隙，第5指(趾)总不受累)。目前已定位的人类SHFM遗传位点包括：SHFMl(7q21，MIM183600)、SHFM2(Xq26，MIM313350)、SHFM3(10q24，MIM600095)、SHFM4(3q27，MIM605289)和SHFM5(2q31，MIM606708)。SHFM3和SHFM4位点的致病突变已经明确，分别是染色体10q24区域内约O．5Mb的DNA串联重复和染色体3q27区域内砰

5、卯(MIM603273)基因的点突变。手足生殖器综合征(Hand．foot．genitalsyndrome，HFGS，MIM140000)是累及手足和泌尿生殖系统的畸形，肢端畸形包括短指(趾)、延迟骨化、融合及腕骨和跗骨短小等。泌尿系统的异常包括输尿管口异位、膀胱输尿管反流和肾盂输尿管接合处梗阻导致慢性肾盂肾炎、肾功能不全和。肾移植。生殖系统畸形包括男性的尿道下裂和女性的苗勒(氏)管融合导致阴道纵隔和双子宫。HFGS为常染色体显性遗传，致病基因为染色体7p15的同源盒基因HOXAl3(HomeoboxA1

6、3，MIM142959)。本文以上述肢端畸形的三个中国人家系(SYMl、SHFM和HFGS)为研究对象，首先利用单体型分析进行了致病基因染色体定位，然后对候选基因DNA测序或定量PCR进行突变鉴定，进一步通过westemblot、双萤光素酶报告基因检测系统和染色质免疫沉淀等技术对突变基因功能进行初步研究。材料与方法1、家系资料对家系中可能追溯到的家庭成员进行详细调查，绘制家系系谱图；签署“知情同意书”；对患者进行体格检查和手足骨骼X光检查；采集外周静脉血。2、单体型分析定位候选致病基因利用UCSC基因组生

7、物信息学网站在5个SHFM位点选择20对微卫星多态标记，PCR扩增后经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，读出每个个体标记的基因型。再根据个体基因型和系谱中的亲缘关系，按照孟德尔遗传定律推导出同一条染色体上不同标记构成的单体型。3、候选基因编码区DNA测序根据单体型分析确定候选基因后，PCR扩增患者候选基因外显子，PCR产物2纯化后测序。4、定量PCR检测基因组拷贝数变异利用实时荧光定量PCR扩增患者候选基因，与『F常个体比较其基因组拷贝数是否发生改变。5、长距离PCR结合DNA测序确定断裂点定量PCR将两侧断

8、裂点范围缩小到2-4kb后，以患者基因组DNA为模板，利用端粒侧重复的正向引物R2．2F及中心粒侧重复的反向引物L10．5R(outfacingprimers)行PCR扩增，PCR产物纯化后测序。6、构建野生型和突变型真核表达载体PCR扩增目的基因GDF5和HOXAl3编码序列，分别与真核表达载体pLXSN和p3xFLAG．CMV7连接后转化感受念细胞，阳性克隆测序验证；以野生型载体为模板，定点诱变产生突变型载体。7、West