分子生物学实验流程及相关试剂仪器概述教学课件

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1、分子生物学实验流程及相关试剂、仪器概述GENECOMPANYLTD2003年8月For江西日博公司分子生物学实验概述生物样品（细胞、组织、细菌）细胞调节神经科学分子诊断DNA分离RNA分离质粒DNA噬菌体DNA基因组DNA总RNAmRNAcDNA重组DNAPCR遗传鉴定DNA测序DNA标记突变基因表达分子生物学实验概述（续）基因表达报告基因载体基因转化报告基因检测真核转录体外转录翻译蛋白蛋白分析蛋白分离分子生物学主要实验流程实验起始材料的选取和准备mRNA的提取、纯化目标片段的克隆和分析DNA、RNA的提取、纯化和分析克隆化基因的表达及表达蛋白

2、的纯化和功能分析基因转化实验及转基因结果分析实验起始材料的选取和准备常规材料组织器官原生质体细胞细菌真菌酵母特殊材料少量起始材料特殊病变组织亚细胞结构实验起始材料的选取和准备水稻卵细胞的分离分离准备工作材料的速冻长期保存人工气候箱、制冰机超净工作台、显微操作系统RNase-free耗材、液氮罐超低温冰箱RNase抑制剂卵细胞mRNA的提取、纯化Oligotex系列试剂盒细胞裂解匀浆去蛋白和细胞残渣温浴并结合洗脱去盐和回收旋涡混匀器离心机恒温水浴锅离心机、旋涡混匀器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free

3、耗材目标片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库目标基因的获得通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体克隆获得目标质粒利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序通过SMART技术构建cDNA文库第一链的合成第二链的合成和扩增酶切、纯化和片段分离cDNA检测插入载体并包装文库质量检测文库扩增及保藏恒温水浴锅、制冰机RTase、RNase抑制剂PCR仪高保真Taq酶恒温水浴锅、离心机限制性内切酶、过滤柱电泳仪器、凝胶成像系统琼脂糖恒温水浴锅超净工作台、烘箱、PCR仪培养基超低温冰箱DMSO目标基因的克隆

4、利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文库目标基因的筛选利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目标基因通过核酸杂交和免疫反应筛库将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非放射性）将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交利用PCR技术获得目标基因利用GSP，以文库为模板通过PCR扩增出

5、目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP，通过5’RACE和3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测DNA、RNA的提取、纯化和分析包含有目标基因的质粒的获得水稻基因组DNA的提取、纯化和分析水稻各器官TotalRNA的提取、纯化和分析包含有目标基因的质粒的获得对于通过筛库技术获得的目标基因通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒对于通过PCR技术获得的目标基因通过回收纯化后利用T载体等克隆并转化细菌铺板培养后通过蓝白斑，原位裂解杂交分离出含有目标质粒的单个

6、菌落对于通过PCR技术获得的目标基因PCR或RACE电泳凝胶成像系统长波紫外观察箱切胶胶回收试剂盒T载体、平末端载体转化细菌并铺板培养筛选目标菌落提取目标质粒对于通过PCR技术获得的目标基因PCR或RACE琼脂水平电泳凝胶成像系统、手提紫外灯长波紫外观察箱PCR回收试剂盒胶回收试剂盒PCR仪电泳仪器恒温水浴锅、离心机Taq酶、薄壁管、矿物油琼脂糖对于通过PCR技术获得的目标基因（续）纯化产物PCR产物测序T载体、平末端载体连接细菌转化、铺板培养蓝白斑筛选、菌落原位杂交质粒提取、酶切分析、测序测序仪低温冰箱杂交箱、恒温摇床、低温冰箱超净工作台、电

7、转化仪离心机、恒温水浴锅感受态细胞、培养基、抗生素X-gal、IPTG、尼龙膜和探针限制性内切酶质粒提取、分析常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒DNA质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒DNA质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切电泳，用凝胶成像系统分析测序水稻基因组DNA的提取、纯化和分析利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质的原理提取基因组D

8、NA利用酚-氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA水稻基因组文库的构建利用特异的探针，通过Southernblotting检测目标基因的拷贝数水稻各器官To