ELISA试剂配制及实验流程—BDY

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1、ELISA试剂配制及实验流程ELISA是酶联接免疫吸附剂测定((Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。以双抗体夹心法举例说明。试剂配制：　　(1)　包被缓冲液(PH9.6+0.20.05M碳酸盐缓冲液)：　　　　　　Na2CO31.59g　　　　　　NaHCO3　2.93g　　　　　　加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA）(2)　洗涤缓冲液(PH7.40.15MPBST)：0.05%Tween-200.5ml加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液：　　　　　　KH2PO4　　　　　0

2、.27g　　　　　　Na2HPO4·12H2O　　3.58g　　　　　　NaCl　　　　　　　8g　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2g　　　　　　加蒸馏水至1000ml。(3)　封闭缓冲液：　　　　　　牛血清白蛋白(BSA)2%2g　　　　　　（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。　　(4)　稀释液：　　　　　　牛血清白蛋白0.1%0.1g　　　　　　加PBS缓冲液100ml。　　(5)　底物缓冲液(PH5.0)：7　　　　0.2MNa2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L)取25.7ml　　　　0.1M柠檬酸(无水19.2

3、g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml　　　　加蒸馏水至100ml。(或Na2HPO4·12H2O1.84g柠檬酸·H2O0.51g加蒸馏水至100ml)　　(6)　TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-　　　　TMB(2mg/ml水)0.05ml　　　　底物缓冲液　　　0.95ml　　　　30%H2O2　　　0.001ml总体积1ml。TMB,1mg/ml-DMSO溶解(7)或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉）0.004g底物缓冲液10ml30%H2O20.015ml总体积10ml。　　(8)　终止

4、液(2M　H2SO4)：　　在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。操作步骤：1.　包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。(简称洗涤，下同)。2.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤。73.　加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37℃温育1~2小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。4.加

5、一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。　　5.　加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。　　6.　加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。　　7.　终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）　　8.　结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅

6、，用“+”、“-”号表示。测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。7间接法操作步骤：1.　包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定），4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。(简称洗涤，下同)。2.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤。3.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤

7、。　　4.　加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。　　5.　加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。　　6.　终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）　　7.　结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用4

8、50nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD