p物质对体外培养成骨细胞增殖和活性的影响

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1、P物质对体外培养成骨细胞增殖和活性的影响【关键词】骨细胞　　EffectofsubstancePonproliferationandactivityofosteoblastsinvitro　　【Abstract】AIM:ToobservetheeffectofsubstanceP(SP)ontheproliferationandactivityofosteoblastsculturedinvitro.METHODS:ThecalvariumboneofneiningtheALPactivityandobservingthechangesofcellcycle.RESULTS:

2、SPof1×10-12-1×10-6mol/Lhadenhancingeffectsontheproliferationandactivityofosteoblasts,ol/Lhadthestrongestenhancingeffects.CONCLUSION:SPhasenhancingeffectsontheproliferationandactivityofosteoblasts.　　【Keyol/L的SP对成骨细胞的增殖和活性都有促进作用，在浓度为1×10-8mol/L对成骨细胞增殖和活性的促进作用最强.结论:SP对成骨细胞增殖和活性有促进作用.　　【关键词】P物质

3、；成骨细胞；增殖；活性　　0引言　　P物质（substanceP，SP）是最早发现的神经肽，已经证实SP神经肽免疫阳性神经纤维的变化贯穿于正畸牙周组织的破坏吸收以及再生修复的整个过程.并且主要是SP，降钙素基因相关肽（CGRP）参与了牙槽骨的改建.SP主要通过与它的受体Neurokinin1受体（NK1受体）结合发挥调节作用.但SP在正畸牙槽骨改建过程中有何作用，目前还不十分清楚.我们通过体外培养大鼠成骨细胞，观察SP对成骨细胞增殖和活性的影响,以期为揭示SP正畸牙槽骨的改建作用和机制提供依据.　　1材料和方法　　1.1材料　　DMEM培养液（Gibco公司），新生牛血清（杭

4、州四季青生物制品公司），MTT（Sigma公司），碱性磷酸酶试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司），TritonX100（华美公司），SP（Sigma公司），DNAprepRegainKit（BeckmanCoulter公司）；酶联免疫检测仪（华东电子管厂），ELITEESP型流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）.　　1.2方法　　1.2.1成骨细胞的培养取出生24h内的SD大鼠（购于第四军医大学实验动物中心）为实验对象，采用颅盖骨消化法培养成骨细胞.待细胞长满培养瓶壁时传代培养，传至第2代时用差速贴壁法除去成纤维细胞.　　1.2.2成骨细胞增殖检测─细胞计数法

5、将第3代的成骨细胞用胰蛋白酶消化，用含100mL/L血清的DMEM培养基稀释成5×107/L的细胞悬液，以每孔1mL接种于24孔培养板.培养24h，然后更换为含有不同浓度SP的培养基继续培养〔终浓度为0（对照），1×10-12，1×10-10，1×10-8，1×10-6mol/L〕，每浓度6个平行孔，48h后消化，计数.　　1.2.3成骨细胞增殖检测─MTT法将第4代的成骨细胞消化，并稀释成5×107/L的细胞悬液，以每孔200μL接种于96孔培养板.培养24h，然后更换为含有不同浓度的SP培养基继续培养，每浓度6个平行孔,常规MTT法测量，使用酶联免疫检测仪测量A490nm

6、值.　　1.2.4成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性检测细胞处理方法同MTT法，用不同浓度的SP培养基培养,每浓度6个平行孔,常规ALP活性检测法检测，通过酶联免疫仪测量A410nm值.　　1.2.5成骨细胞的细胞周期检测将第3代的成骨细胞消化后稀释，每50mL培养瓶接种5mL细胞悬液.培养24h，然后更换为含有不同浓度SP的培养基继续培养48h，再次消化，洗涤，固定，4℃过夜.调整细胞数在1×109/L，各样本加入DNAprepstain染液500μL，避光染色30min，用ELITEESP型流式细胞仪测定DNA含量，并用Multicycle软件分析细胞周期分布情况.　　统计

7、学处理：数据以x±s表示，使用SPSS10．0forTT计数及ALP活性结果影响最大，其A值与对照组有显著差异(P0.01,表1).当SP在1×10-8mol/L时，对细胞周期影响最大，S+G2M期细胞数量最多(表2).表1成骨细胞细胞计数、MTT、碱性磷酸酶活性测定(略)表2成骨细胞的细胞周期测定（略）　　3讨论　　在人体多种骨组织内分布有SP样神经纤维，包括长骨，关节，牙齿等.以往的研究证实SP与骨代谢联系密切.在骨折愈合过程中，发现SP样神经纤维与毛细血管一同出现在新生骨组织的周围；Sandhu等