日本医蛭不同萃取部位体外抗凝活性的实验研究

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1、日本医蛭不同萃取部位体外抗凝活性的实验研究姚楠余顺慧相宇李友宾【摘要】　　目的研究日本医蛭不同萃取部位的抗凝活性，为日本医蛭的新药开发提供依据。方法SD大鼠腹主脉取血，应用血凝仪体外测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化的部分凝血活酶时间(APTT)。结果日本医蛭的总提物能使大鼠PT，TT，APTT时间显著延长；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延长。结论中药日本医蛭的低极性小分子具有抗凝活性。【关键词】日本医蛭抗凝血　　水蛭作为药用，历史悠久。在中国，水蛭始载于《神农本草经》，谓其能“逐恶血、瘀血”“破血瘕积聚”。临床广泛用

2、于血栓形成、冠心病、脑水肿的治疗〔1〕。世界上蛭类有数百种，中国也有近百种。《中国药典》2005年版收载水蛭科动物蚂蝗aniapigraan、日本医蛭Hirudonipponicaan和柳叶蚂蝗aniaacranulataan3种〔2〕。现在公认水蛭的活性成分为水蛭素，它是从医蛭的唾液腺中提取出来的一种多肽，是作用很强的凝血酶抑制剂，具有抗凝、抗血栓等药理作用。而中药传统应用炮制的水蛭入药，即水蛭要经过开水烫死晒干或砂炒，水蛭素完全被破坏〔3，4〕，然而水蛭的破血、通经的功效仍然得以保留，这说明水蛭中含有除水蛭素外的其它抗凝血成分。目前

3、人们对水蛭中蛋白多肽类活性成分研究较多，如抗凝血物质水蛭素以及肝素、抗血栓素抗炎酶和溶血酶及组胺样物质〔5〕，而对小分子研究报道较少。有人研究了蚂蝗的不同极性小分子部位的抗凝活性，证明中等极性的小分子具有较强的抗凝活性〔6〕。本文报道日本医蛭不同萃取部位体外的抗凝活性，以期寻找其他有效的抗凝血小分子成分。　　1材料与仪器　　1.1动物SpragueDaan，标本保存于江苏省中医药研究院中药化学室，标本号2004-09-08。　　1.3试剂枸橼酸钠（分析纯，中国上海试剂一厂，批号20020912）；水合氯醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公

4、司，批号T20060922）；TT，PT，APTT试剂（上海希森美康医用电子有限公司，产品标准号ZB/DadeBehing-04-2002。　　1.4仪器普利生PLSC2000-4型血小板聚集凝血因子分析仪。　　2方法　　　　2.1样品液的制备日本医蛭干品，加8倍量95％的乙醇回流提取3次，1.5h/次。合并3次提取液，减压挥去溶剂得到总提物。将总提物分散于水中，分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取（正丁醇萃取后剩下的部分为水部位），各萃取物挥去溶剂分别得到石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位和水部分。分别称取总提取物2g，石油醚部位1.1g，氯

5、仿部位0.044g溶解于10ml的二甲亚砜中，正丁醇部位0.754g，溶于10ml3％吐温，水部位0.646g溶于10ml生理盐水，使各部位样品液浓度均为830mg生药/ml。　　2.2凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)的测定选用SD雄性大鼠，10％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以3000r/min，离心15min，取血浆100μl，加入药液10μl，预温3min后加入预温好的PT，TT试剂200μl，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。　　2.3活化的部分凝血活酶时间(APTT)的测定按“

6、2.2”方法分离出血浆，取血浆100μl，加入10μl药液和APTT试剂100μl，预温3min后加入预温15min的CaCl2100μl，用血小板聚集凝血因子分析仪测定凝固时间。　　2.4统计方法统计方法用One-way-ANOVA，多组间两两比较，用LSD(Least-Signfieant-Diference)统计。　　3结果　　3.1日本医蛭提取部位的抗凝血活性结果见表1～3。结果表明，总提物能使大鼠PT，TT，APTT时间显著延长；石油醚部位能使大鼠PT，APTT延长。经SPSS软件单因素方差分析，日本医蛭总提物、石油醚部位抗凝

7、活性作用明显强于其他提取部位。　　表1日本医蛭总提物、石油醚部位、氯仿部位对大鼠PT，TT，APTT的影响（略）　　与二甲亚砜比较，*P0.05；n=4　　表2日本医蛭水部位对大鼠PT，TT，APTT的影响（略）　　表3日本医蛭正丁醇部位对大鼠PT，TT，APTT的影响（略）　　3.2提取物浓度与抗凝血活性的关系总提物和石油醚部位的浓度越高其抗凝血作用越强。在实验范围内，总提物的浓度与PT，TT，APTT凝血指标的延长呈线性关系。见图1～2。　　图1总提物浓度与凝血活性之间的关系（略）　　图2石油醚部位浓度与凝血酶原时间之间的关系（略）

8、　　4讨论　　凝血过程是一系列的酶促反应，包括内源性，外源性凝血系列和共同途径。凝血酶原时间（PT），活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶时间（TT）分别反映了外源性凝血系统和内源性凝血系统的活性。其中