肉桂醛、柠檬醛抑制黄曲霉生长机制研究

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1、肉桂醛、柠檬醛抑制黄曲霉生长机制研究【摘要】目的研究中药活性成分肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉细胞膜麦角固醇生物合成的影响，以探讨其抗菌的作用机制。方法将黄曲霉接种在含有不同浓度药物的蔡氏固体培养基中，同时设不加药物为空白对照，置265℃恒温培养3d，刮取平皿上菌苔，称重、皂化，提取真菌中的难皂化脂，高效液相色谱(HPLC)法测定其中的麦角固醇含量。结果柠檬醛浓度为016μg/ml、肉桂醛浓度为009μg/ml作用黄曲霉后，麦角固醇含量较未用药组显著降低。结论肉桂醛、柠檬醛可能通过影响黄曲霉麦角固醇的生物合成抑制黄曲霉生长。【关键词】肉桂醛　　黄曲霉广泛分布于自然界，极易引起物品霉变

2、。食品等物品霉变除造成直接重大的经济损失外，某些产毒株产生的毒素，还可导致肿瘤高发，严重危害人和动物健康〔1〕。目前主要利用化学防腐剂抑制真菌的生长，化学防腐剂种类繁多，广泛应用于食品方面的有山梨酸、苯甲酸、丙酸及其盐类以及纳它霉素等，但这些防腐剂防霉效果不是很理想，而且对人和动物多有潜在的毒性。中药活性成分肉桂醛、柠檬醛作为食品防腐剂已应用于食品工业，但对其抗菌机制研究较少。本研究室实验表明，中药活性成分肉桂醛、柠檬醛有良好的抗黄曲霉作用〔2-5〕。本文用高效液相色谱(HPLC)法测定了肉桂醛、柠檬醛作用黄曲霉后真菌细胞膜麦角固醇含量的变化，以期探讨抗真菌的作用机制，旨在为开发新

3、型的食品天然防腐剂提供理论依据。　　1材料与方法　　11实验菌株黄曲霉菌为标准株(CCCCMIDA2)〔中国医学真菌中心(南京)〕。　　12仪器与试剂yknm高效液相色谱仪(美国Gilching公司)；真菌培养箱；紫外分光光度计等。肉桂醛(中国上海双喜香料制剂厂)，比重1047～1051(批号：20020401，纯度＞95％)；柠檬醛(德国BerlinrangVnitdenAugendeHautvermiden公司)批号：002489S20085632，纯度98%。，比重0887～0889(批号：002489S20085632，纯度＞98％)；酮康唑(纯度：200mg

4、/片，批号：030418108，西安杨森制药有限公司)，临用前将酮康唑研成细粉并溶于二甲基亚砜，使其浓度为40mg/ml；麦角甾醇(美国Sigma公司)，用环己烷配成10mg/ml，-20℃保存；乙腈为色谱纯；皂化剂：新鲜配制的含15%NaOH的90%乙醇溶液；蔡氏培养液〔6〕；其他试剂均为分析纯。　　13方法　　131菌液制备将试验菌株接种于蔡氏斜面，26℃培养至快速生长早期，活化2次，此时菌苔覆盖斜面，加入蔡氏液体，吸管吹打菌苔使孢子游离于培养液中，用500目无菌尼龙网过滤，滤液经血细胞计数板计数及紫外分光光度计测定，调整孢子浓度为106个/ml。　　132不同浓度

5、药液的制备参照文献〔2，5〕，于无菌、直径为15cm的平皿内分别加入柠檬醛916，611μl，肉桂醛6364，4364μl，酮康唑4μl，将冷却至50℃左右的蔡氏固体培养基50ml迅速倒入上述平皿内，混匀(药物终浓度分别为：柠檬醛，016，008μg/ml；肉桂醛，013，009μg/ml；酮康唑，32μg/ml)，待其凝固。　　133高效液相色谱HPLC法测定肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉细胞膜麦角甾醇含量的影响(1)样品制备：将131制备的菌液接种在含有不同浓度药物的蔡氏固体培养基中(孢子终浓度为104个/ml)，同时设不加药物为空白对照，置265℃恒温培养

6、3d，刮取平皿上的菌苔，称菌湿重。各精密称取湿菌约05g，加磷酸盐缓冲液(PBS)25ml和皂化剂6ml，混匀，80℃水浴皂化60min。加石油醚(沸程30～60℃)6ml提取3次，合并提取液，加水6ml洗涤2次，醚层于60℃水浴挥干，得未皂化脂〔7〕，加环己烷溶解使溶液体积为1ml/g湿菌，-20℃保存。(2)高效液相色谱条件：色谱柱：C8柱；流动相：已腈-水(95∶5)；流速，10ml/min；检测波长283nm，采用外标法按峰面积进行定量。(3)标准曲线绘制：精密称取25mg麦角甾醇标准品，用环己烷溶解配成10mg/ml作标准贮备液。用标准贮备液分别配制05，02

7、5，0125，00625，00325，001625mg/ml等6份标准液，在(2)中建立的色谱条件下进样20μl，每个浓度进样2次，以峰面积的均值为纵坐标，样品浓度为横坐标作标准曲线，进行回归处理。(4)精密度测定：在本实验条件下，将025，0125，00625mg/ml的标准溶液分别于日内及日间进样，测定日内及日间相对标准差。每个样品重复进样2次。(5)样品测定：将(1)中制备好的样品用本实验建立的色谱条件分别进样20μl，每个样品进样2次，测定样品中