肉桂醛、柠檬醛抑制黄曲霉生长机制研究论文

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1、肉桂醛、柠檬醛抑制黄曲霉生长机制研究论文【摘要】目的研究中药活性成分肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉细胞膜麦角固醇生物合成的影响，以探讨其抗菌的作用机制。方法将黄曲霉接种在含有不同浓度药物的蔡氏固体培养基中，同时设不加药物为空白对照，置265℃恒温培养3d，刮取平皿上菌苔，称重、皂化，提取真菌中的难皂化脂，高效液相色谱(HPLC)法测定其中的麦角固醇含量。结果柠檬醛浓度为016μg/ml、肉桂醛浓度为009μg/ml作用黄曲霉后.freel高效液相色谱仪(美国Gilching公司)；真菌培养箱；紫外分光光度计等。肉桂醛(中国上海双喜香料制剂厂)，比重1047～1051(批号：20020401，

2、纯度＞95％)；柠檬醛(德国BerlinrangVnitdenAugendeHautvermiden公司)批号：002489S20085632，纯度98%。，比重0887～0889(批号：002489S20085632，纯度＞98％)；酮康唑(纯度：200mg/片，批号：030418108，西安杨森制药有限公司)，临用前将酮康唑研成细粉并溶于二甲基亚砜，使其浓度为40mg/ml；麦角甾醇(美国Sigma公司)，用环己烷配成10mg/ml，-20℃保存；乙腈为色谱纯；皂化剂：新鲜配制的含15%NaOH的90%乙醇溶液；蔡氏培养液〔6〕；其他试剂均为分析纯。13方法131菌液制备将试验

3、菌株接种于蔡氏斜面，26℃培养至快速生长早期，活化2次，此时菌苔覆盖斜面，加入蔡氏液体，吸管吹打菌苔使孢子游离于培养液中，用500目无菌尼龙网过滤，滤液经血细胞计数板计数及紫外分光光度计测定，调整孢子浓度为106个/ml。132不同浓度药液的制备参照文献〔2，5〕，于无菌、直径为15cm的平皿内分别加入柠檬醛916，611μl，肉桂醛6364，4364μl，酮康唑4μl，将冷却至50℃左右的蔡氏固体培养基50ml迅速倒入上述平皿内，混匀(药物终浓度分别为：柠檬醛，016，008μg/ml；肉桂醛，013，009μg/ml；酮康唑，32μg/ml)，待其凝固。133高效

4、液相色谱HPLC法测定肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉细胞膜麦角甾醇含量的影响(1)样品制备：将131制备的菌液接种在含有不同浓度药物的蔡氏固体培养基中(孢子终浓度为104个/ml)，同时设不加药物为空白对照，置265℃恒温培养3d，刮取平皿上的菌苔，称菌湿重。各精密称取湿菌约05g，加磷酸盐缓冲液(PBS)25ml和皂化剂6ml，混匀，80℃水浴皂化60min。加石油醚(沸程30～60℃)6ml提取3次，合并提取液，加水6ml洗涤2次，醚层于60℃水浴挥干，得未皂化脂〔7〕，加环己烷溶解使溶液体积为1ml/g湿菌，-20℃保存。(2)高效液相色谱条件：色谱柱：C8柱；流动相：已腈-水(95∶

5、5)；流速，10ml/min；检测波长283nm，采用外标法按峰面积进行定量。(3)标准曲线绘制：精密称取25mg麦角甾醇标准品，用环己烷溶解配成10mg/ml作标准贮备液。用标准贮备液分别配制05，025，0125，00625，00325，001625mg/ml等6份标准液，在(2)中建立的色谱条件下进样20μl，每个浓度进样2次，以峰面积的均值为纵坐标，样品浓度为横坐标作标准曲线，进行回归处理。(4)精密度测定：在本实验条件下，将025，0125，00625mg/ml的标准溶液分别于日内及日间进样，测定日内及日间相对标准差。每个样品重复进样2次。(5)样品测定：将(1

6、)中制备好的样品用本实验建立的色谱条件分别进样20μl，每个样品进样2次，测定样品中麦角甾醇的含量(n=3)。14统计分析采用SPSS110软件进行分析。2结果21标准品麦角甾醇的出峰时间按本实验建立的色谱条件进样。结果显示，麦角甾醇的出峰时间在16～17min。22标准曲线麦角甾醇含量在05～001625mg/ml范围内的线性回归方程为：y=4743636x+0507256(n=6,.freell、肉桂醛009μg/ml作用黄曲霉后，麦角固醇含量较相应未用药组减低，差异有统计学意义(P＜001)，见表2。表1麦角固醇的精密度测定（略）表2用药前后黄曲霉麦角固醇含量比较（略

7、）注：与相应对照组比较，*P＜005，**P＜0013讨论肉桂醛、柠檬醛是肉桂、山苍子油的主要成分，且两者已分别用于化工、食品、粮食防腐、医疗卫生。实验表明，两者有良好的广谱抗真菌作用特别是有高效的抗曲霉作用。张文娟〔8〕、罗曼〔9〕等研究了柠檬醛致黄曲霉的形态结构和某些宏观影响。麦角甾醇是真菌细胞质膜的重要组成成分，它是一种准平面体分子，通过与磷脂结合稳定磷脂相，从而增加膜的稳定性。麦角甾醇