急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6-巯基嘌呤及其代谢产...

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1、急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6－巯基嘌呤及其代谢产物的HPLC分析项目完成人：牟德海郑家概闫世平辜英杰喻凌寒项目完成单位：中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室6－巯基嘌呤（6-mercaptopuring,6－MP）和硝基咪唑硫嘌呤（azathiopurine,Aza）主要作为抗肿瘤药用于治疗急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblasticleukemia,ALL），或者作为免疫抑制剂用于治疗炎性肠病、风湿关节炎、系统性红斑狼疮和抑制器官移植病人的急性排斥。Aza是6－MP的1－甲基－4－硝基－5咪唑硫衍生物，

2、在体内降解生产6－MP，Aza抗肿瘤和免疫抑制的药物活性主要是来自其降解产物6－MP的代谢产物。图1.6－巯基嘌呤的代谢[1]3796－MP在体内的代谢主要有三条途径：（1）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase，HGPRT）的作用下转化为6－硫次黄嘌呤核苷一磷酸（6-thioinosinemonophosphate，TIMP），TIMP随后在一系列酶促反应中转化为活性代谢物6－硫鸟嘌呤核苷（6－thioguaninenucleotides,6－TGNs）发挥

3、细胞毒作用；（2）在硫嘌呤甲基转移酶（thiopurinemethyltransferase，TPMT）作用下转化为无药物活性的甲基硫嘌呤（6－methylmercaptopurine,6－MMP）;（3）在黄嘌呤氧化酶（xanthineoxidase，XO）作用下转化为6－硫尿酸（6－thiouricacid,6－TUA）[1]，见图1。与6－MP转化为活性代谢产物性6－TGNs相竞争的有两条途径：在TPMT作用下转化为6－MMP和在XO作用下转化为6－TUA。XO活性在个体之间的差异不大，而TPMP活性在不同个体之间有很大的差异。因而病

4、人对6－MP反应（即药物的疗效和毒性）的差异主要决定于其体内TPMT的活性。已经发现红细胞中6—TGNs的含量与TPMT的活性呈负相关关系。在标准用药剂量下，TPMT活性低的个体能积累高浓度的6－TGNs导致致死性的骨髓细胞毒性。相反TPMT活性高的个体对硫嘌呤类药物可能没有反应，因为它们很快就被转化为无活性的6－MMP。因而通过监测接受硫嘌呤类药物治疗的病人血红细胞内6－MMP和6－TGNs的水平，据此确定准确的用药剂量，对提高治疗效果、减小药物毒副作用是非常关键的。在本项目的资助下，我们与广州医学院第一附属医院合作，研究建立了急性淋巴细

5、胞白血病患者红血球中6－MP及其代谢产物的高效液相色谱分析方法，为6－MP个性化治疗提供基础。1实验1.1仪器与试剂6－巯基嘌呤（6－mercaptopurine,6－MP）、6－硫鸟嘌呤（6－thioguanine,6－TG）、6－硫黄嘌呤（6－thioxanthine,6－TX）、6－甲基硫嘌呤（6－methylmercaptopurine,6－MMP）、戊醇、乙酸苯汞（phenylmercuryacetate,PMA）和二硫苏糖醇（DL－dithiothreitol,DTT）为Sigma公司产品；甲醇、甲苯为色谱纯，其他试剂均为分析纯

6、。高效液相色谱仪：岛津LC－6A，配LC－6A高压输液泵、柱温箱、SPD-6AV可变波长紫外－可见分光检测器、系统控制器、CR－3A积分仪和色谱工作站。1.2试剂配制（1）PMA－戊醇－甲苯溶液的配制：取1.85mL戊醇，加入1000mL甲苯中，摇匀，再加入0.5gPMA，轻轻搅动1h使PMA溶解，置于暗处保存。此溶液含PMA1.3379mmol/L，含戊醇170mmol/L。（2）3.75mmol/LDTT水溶液配制：取289.2mgDTT溶于500mL水中。（3）0.5mol/LH2SO4。（4）3.4mol/LNaOH。（5）0.1m

7、ol/LHCl。1.1标准溶液配制分别取16.8mg6－TG、16.6mg6－MMP、17.0mg6－TX和17.1mg6－MP溶于水中并定容于100mL，此溶液为贮备液I，含每种硫嘌呤1.00μmol/mL。取10mL贮备液I，稀释至100mL，为贮备液II，含每种硫嘌呤100nmol/mL；用贮备液II稀释成1nmol/mL、2nmol/mL、5nmol/mL、10nmol/mL、15nmol/mL和20nmol/mL的系列标准溶液备用。1.2样品处理（1）血红细胞制备：采集正在接受硫嘌呤治疗的病人全血样本，肝素锂抗凝，室温下1000×

8、g离心10min，弃去血浆和白血胞，红细胞以2倍体积的生理盐水洗涤两次，最后红细胞重新悬浮于生理盐水中，使红细胞的浓度约为8×108细胞/200μL。取少量作红细胞的准确计数，其