胆管癌细胞层黏连素受体过表达上调fas配体的研究

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1、胆管癌细胞层黏连素受体过表达上调Fas配体的研究作者：高占峰李天宇高应鸿蒋卫伟吴虹晔王曙光【摘要】目的探讨胆管癌细胞层黏连素受体(lamininreceptor,LNR)过表达与Fas配体(Fasligand,FasL)作用的关系。方法采用脂质体转染法转染顺义、反义LNR寡核苷酸至胆管癌细胞QBC939中，用RTPCR和细胞免疫组织化学方法检测两组细胞FasL及LNR的表达情况。结果转染反义组LNR和FasL基因表达均较转染顺义组明显降低(t=14.136,25.161,P<0.01)。结论LNR过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用可能是通过FasFa

2、sL信号通路实现的。【关键词】胆管肿瘤；层黏连素受体；Fas配体【Abstract】ObjectiveToexploretherelationshipbetininreceptor(LNR)andFasligand(FasL)incellsofcholangiocarcinoma.MethodsSenseandantisenseoligonucleotidesofLNRacelllineQBC939bythemethodofliposometransfection.TheexpressionsofFasLandLNRmunohistochemistry.R

3、esultsparedmuneevasionofcholangiocarcinomaisrealizedviatheFas/FasLpatha;Lamininreceptor;Fasligand层黏连素(laminin，LN)是细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的主要成分。肿瘤细胞膜上含有其配体即层黏连素受体(lamininreceptor，LNR)，两者结合可诱导分泌包括IV型胶原酶在内的蛋白水解酶,后者有助于肿瘤细胞的侵袭和转移。我们前期研究发现LNR过表达与临床胆管癌恶性表型关系密切［1-4］。本研究将探讨LNR在胆管癌免疫

4、逃逸机制中与Fas配体(Fasligand,FasL)作用的关系。1材料与方法1.1试剂RPMI1640培养液、胰酶和胎牛血清均购自美国Hyclone公司；鼠抗人层黏连蛋白受体单克隆抗FastTMTransfectionReagent转染试剂盒和SVTotalRNAIsolationSystem试剂盒购自美国Promega公司；逆转录试剂盒购自杭州博日科技公司；PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司。1.2细胞培养人肝外胆管癌细胞株QBC939是一株来源于人肝门部胆管癌的右肝转移灶，为低分化腺癌，由本研究所王曙光建株保存［5］。在37℃，5%CO2条件下，含

5、10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/L)的RPMI1640培养液进行细胞培养和传代。1.3设计合成LNR顺义、反义寡核苷酸按反义寡核苷酸的设计要求，针对LNRmRNA序列(GeneBank：NM002295)核心区的AUG上、下游序列，设计18聚同源和互补的寡核苷酸［6］。所设计的序列如下：LNR反义寡核苷酸序列(18mer)：5’GGCTCCGGACATTGTGAA3’；LNR顺义寡核苷酸序列(18mer)：5’TTCACAATGTCCGGAGCC3’。LNR顺义、反义寡核苷酸(全硫代修饰)+绿色荧光标记由上海生物工程

6、技术服务有限公司合成。1.4顺义组、反义组LNR细胞转染取对数生长期QBC939细胞5×105个/ml，采用脂质体转染法，具体操作方法同参考2.3顺义组、反义组LNRQBC939细胞RTPCRLNR和FasLmRNARTPCR检测结果见图7。用Quantityone凝胶定量分析软件对RTPCR凝胶条带进行灰度扫描分析(图8)。转染反义组LNR和FasL基因表达均较转染顺义组明显降低(t=14.136,25.161,P<0.01)。3讨论在大多数情况下，肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监视和攻击，进而在体内不受限制地生长和发生远处转移。其中，肿瘤细胞上

7、调FasL的表达就是其中的机制之一。FasL是相对分子质量为40×103的Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族成员，通过与细胞膜受体Fas结合激活Fas介导的死亡信号复合体，最终导致细胞凋亡。很多恶性肿瘤细胞包括结肠癌、胃癌、肺癌及脑胶质瘤等自身存在FasL过表达。高表达FasL可能通过诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTLs)和NK细胞凋亡，抑制CTLs和NK细胞由Fas介导的杀伤肿瘤细胞作用，产生所谓肿瘤细胞的“反击”现象［8-9］。而且，在转移性肿瘤中，如在乳腺癌淋巴结转移灶及结肠癌肝转移灶中，FasL的表达明显高

8、于原发灶肿瘤，并通过FasFasL途径诱导免疫细胞凋亡，从而抑制