骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

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1、骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究【摘要】［目的］观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。［方法］将速固化壳聚糖磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液，细胞融合80%传代，取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养，分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。［结果］用酶标仪检测OD值提示共培养后，支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为

2、多孔结构，孔内见有细胞生长，细胞表面可见分泌颗粒。［结论］速固化壳聚糖磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性，细胞可在材料内黏附和增殖，是理想的骨组织工程支架材料。【关键词】磷酸钙；壳聚糖；骨髓间充质细胞；组织工程；体外培养　　组织工程是将大量细胞三维有序化构成组织，而支架材料是使细胞有序化三维排列所必需的载体。在骨组织工程支架材料中，磷酸钙骨水泥因具有易塑形和可注射等特点而成为目前研究的热点〔1〕。而经过近年来的强韧化和速固化等改性处理后，磷酸钙骨水泥在临床上应用将更具实用性。骨髓间充质干

3、细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）因具有强大的增殖和多向分化能力而成为目前组织工程研究中最常用的种子细胞来源。本研究观察新型速固化壳聚糖磷酸钙骨水泥支架材料与成人MSCs细胞共培养后，材料对细胞黏附和增殖的影响，以评价该材料的细胞相容性。　　1材料与方法　　1.1主要试剂和仪器　　DMEMLG培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（天津TBD公司），地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸（Sigma公司），四甲基偶氮唑蓝MTT、二甲基亚砜DMSO、乙二胺四乙酸EDTA（Amresc

4、o公司），680型酶标仪（美国BIORAD公司），XL30ESEM扫描电镜（PHILIPS公司）。　　1.2方法　　1.2.1壳聚糖磷酸钙骨水泥的制备　　将主要成分为壳聚糖溶液（脱乙酰度为93%，分子量约942000）的液相及固相的磷酸三钙粉末（均由暨南大学理工学院材料科学与工程学院提供）用γ射线消毒备用。在室温下，将固相和液相以0.7g：1ml比例置于培养皿内混合，搅拌均匀成糊状后，置于模具中成形。约5min后材料基本凝固，失去流动性。　　1.2.2成人MSCs细胞培养　　从年轻健康志愿者髂前上棘

5、处抽取肝素化骨髓约3ml，采用全骨髓分离培养法。细胞生长至瓶底约90%面积时，按1：3进行传代培养。取第3代人骨髓MSCs细胞用于实验。　　1.2.3细胞与支架材料复合培养　　材料预湿：将成形材料置于6孔培养板上，浸于完全培养基中预湿1h。　　细胞准备:将第3代人骨髓MSCs用0.25%胰酶消化，制成1.0×106个／ml的细胞悬液。　　细胞与材料联合培养：采用沉淀法接种细胞。将200μl细胞悬液滴于材料上，将6孔板置于培养箱中，接种3h后，加入完全培养基并使之完全浸泡材料。之后每3d换液1次。　　1.2

6、.4MSCs在支架材料中的活力检测（MTT法）　　用MTT法检测细胞在材料中的增殖情况。将细胞与材料共培养后第1d起，隔天取一材料，用PBS冲洗后，0.25%胰酶及0.02%EDTA消化材料中的细胞，收集细胞，加入孔板中。加入MTT10μl，37℃温育4h，加入100μlDMSO，在酶标仪上560nm处测定OD值。　　1.2.5组织工程材料扫描电镜（SEM）分析　　在细胞-材料共培养1周后用扫描电镜进行观察。将标本经PBS清洗后，置于体积分数为2.5%戊二醛溶液中固定过夜，30%～100%梯度酒精脱水，醋

7、酸异戊酯置换，临界点干燥、喷金，用PHILIPSXL30ESEM扫描电镜观察。　　2结果　　2.1成人骨髓MSCs培养光镜观察　　原代72h首次换液后，可见部分细胞贴壁，细胞呈圆形、椭圆形或梭形。多数细胞呈集落样生长，边缘细胞为梭形。散在细胞多为梭形，体积较大。3周左右，细胞融合可达瓶底面积约90%。这时细胞成簇状或旋涡状生长，细胞多为细短的梭形。传代24h后，大部分细胞贴壁，少量悬浮细胞在换液时去除。5～7d，细胞融合可达瓶底面积约90%，细胞为长梭形，形态均一（图1）。　　2.2成人骨髓MSCs在支

8、架材料中的活力检测　　活细胞线粒体脱氢酶能将MTT还原成甲臢（formazan）。甲臢为紫色结晶，可溶于DMSO。用酶标仪在560nm波长处测定其OD值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲臢结晶物形成的量与细胞数成正比。本实验通过MTT法检测显示细胞与支架联合培养后，细胞在材料中具有增殖活力（图2）。　　图1第3代人骨髓间充质干细胞（100×）（略）　　图2细胞在材料中的增殖情况（略）　　2.3SEM观察细胞与材料复