精子染色质扩散实验检测精子dna碎片与宫腔内人工授精妊娠率及关系

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1、精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系作者：曹晓敏苏园园何茜冬郑轶群林仲秋【摘要】目的：探讨精液DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系。方法：收集分析70例不育不孕患者共88个IUI治疗周期，精子染色质扩散(SCD)实验分析精子DNA碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，并按妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组，比较各组间精子DNA碎片比值、精子核成熟度和IUI妊娠率的关系。结果：非妊娠组SCD小光晕和无光晕精子(精子DNA碎片)比值平均为(28.3±10.6)%,非妊娠组明显高于对照组(12.0±5.9)%(P<0.

2、05);而大光晕和中光晕精子比值非妊娠组明显低于对照组(P<0.05);非妊娠组组苯胺蓝染色阳性率明显高于对照组。结论：非妊娠组患者核成熟度异常的精子、精子DNA碎片比例增高。【关键词】复发性流产;精子;DNA损伤宫腔内人工授精(intrauterineinsemination,IUI)是将洗涤处理过的精子悬液通过导管直接注入子宫腔内，使精卵自然结合达到妊娠生育目的的一种辅助生育技术，其适用人群广泛。影响IUI成功的因素诸多，目前尚无定论。大部分研究主要集中在女方年龄、不孕的年限、授精时机及次数、用药方案、局部盆腔结构、子宫内膜厚度、

3、输卵管壶腹部的直径、输卵管伞端距宫角的距离、精子质量与IUI妊娠率的关系[1～3]。关于精子质量与IUI妊娠率的研究通常是在常规精液分析水平上进行。其提供的信息不能很好评估精子的质量。在预测妊娠结局方面的价值十分有限。本课题拟通过对精子DNA完整性、精子核成熟度的检测来分析精子质量与IUI妊娠率的关系[4]，本研究对2008年8月～2009年12月来我院生殖中心行IUI治疗的70例男方精液进行分析，精子染色质扩散(SCD)实验分析精子DNA碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，探讨上述指标与IUI妊娠率的关系。　　1资料与方法　　1.1

4、一般资料　　2008年8月～2009年12月来我院生殖中心行IUI治疗患者70例共88个周期，治疗前需证实女方至少有一条输卵管通畅及无排卵功能障碍，并排除盆腔炎症和女性生殖内分泌异常等潜在的不孕因素的影响。我们将88个IUI周期根据妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组。　　1.2主要试剂与仪器　　ISAS精子分析系统(西班牙);NIKONE1000荧光显微镜(日本);NIKONE200普通光学显微镜(日本)。主要试剂：低熔点琼脂、标准琼脂、二硫苏糖醇(DTT)、联咪二苯吲哚(DAPI)，均购自美国Sigma公司。　　1.3标本采集　　受检

5、者应禁欲3～7d，用手淫或体外排精法收集精子，标明采集的时间，置37℃平板上液化后进行检测。　　1.4SCD实验　　根据文献[5，6]，精液标本处理：精液标本用磷酸盐缓冲液(pH6.8)调至10×106/ml1000rpm10min，弃精浆，精子沉渣用磷酸盐缓冲液(pH6.8)调至1×106～10×106/ml，取0.3ml处理好的精液与0.7ml1%低熔点琼脂凝胶混匀，37℃孵育;吸取50ul上述精子混合液滴在经过0.65%正常熔点琼脂预处理过的载玻片上，盖上22mm×22mm盖玻片4℃放置5min。精子变性及裂解：小心去除盖玻片，

6、室温(22℃左右)将标本载玻片浸入0.08mol/l的盐酸(HCL)内变性7min;然后浸入精子裂解液内(pH7.3)20min;再移入缓冲液中3min，脱水。将标本载玻片依次放入70%、90%和100%的乙醇中脱水。所有操作过程均要求载玻片(标本)处于水平状态。空气自然干燥后加入4′，6二脒基吲哚(DAPI)染色，荧光显微镜下观察结果。　　1.5精子核蛋白组型检测　　精液液化并记数，洗涤调整精子密度至40×106/ml，取精液1ml，1000g离心3min，去上清液，重复3次，去除精浆加入1ml粘合液，取5ul涂片，空气干燥，加固

7、定液固定90s，冲洗玻片，脱色、封片。镜检:涂片经苯胺蓝染色后，显微镜下高含赖氨酸的精子核呈蓝色，颜色分布基本均匀，一般在精子核后半部分着色较深，顶体部分蓝色较浅，大部分精子不显色，显蓝色的为阳性，不显色的为阴性，每个标本计数200个精子。　　2统计学处理　　数据输入计算机SPSS(12.0版)软件，经t检验进行统计处理。P<0.05认为有统计学差异。3结果　　3.1DNA完整性检测结果　　SCD实验普通光学显微镜图片见图1。计数500个精子，观察精子光晕大小。根据光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕4个等级，大和中光晕

8、表示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片。小光晕以精子头直径≤1/4为判断标准;中光晕精子头直径>1/4，而精子头直径≤2/3;大光晕精子头直径>2/3。精子SCD实验显示大、中、小光晕和无光晕精子的