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1、毛莨总苷心血管药理功能分析-->第一部分毛茛总苷对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响1药物、仪器和动物1.1药物DMEM液体细胞培养基，Hyclone公司，批号：NSG0054胎牛血清(FBS)，Hyclone公司，批号：20060404胰蛋白酶，Sigma分装，批号：DH355-2磷酸缓冲液(PBS)，北京鼎国生物技术有限责任公司青霉素，Sigma分装,批号:DH231-1链霉素，Sigma分装,批号:DH325噻唑蓝(MTT)，Sigma分装，批号：DH343-1三氯醋酸,Genebase,批号:G2365二甲基亚砜，北京鼎国生物技术有限责任公司毛茛总苷，广
2、东药学院药理教研室制备重酒石酸去甲肾上腺素注射液，酚妥拉明注射液，尼莫地平注射液，均购自上海禾丰制药有限公司。1.2仪器细胞培养箱,美国Thermo电子电器公司生物荧光倒置显微镜（LeicaIM50），德国莱茨公司净化工作台（Sodel680型）,日本Bio-Rad公司酶标仪2（ELX800），美国Biotech公司低速离心机（LD4-2A型）,北京医用离心机厂立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-30SⅡ）,上海博迅实业有限公司医疗设备厂移液器，上海艾本德生物技术国际贸易有限公司酸度计（PHS-25型）,上海雷磁仪器厂磁力搅拌器（JB-2型）,上海雷磁新泾仪器
3、有限公司回旋式振荡器（HY-5型）,江苏金坛市宏华仪器厂数显鼓风干燥箱（GZX-9240MBE）,上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热恒温水槽（DK-8D型）,上海一恒科技有限公司自动双重纯水蒸馏水器（SZ-93）,上海雅荣生化设备仪器有限公司96孔培养板,Corning3.5cm培养皿,Corning25cm2或75cm2培养瓶,Greinerbio-one15ml或50ml离心管,Falcon1.3动物SPF级SD成年大鼠，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-002，粤监证字2005A010；体重200g。2实验方法2.1血管平
4、滑肌细胞的分离和培养(1)PBS液:取PBS浓缩液一瓶(50ml)及8.5gNaCl粉末,加三蒸水定容至1L,搅拌混匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。(2)D-Hanks缓冲液的配制：NaCl8g，KCl0.4g，NEHPO4•12H2O0.1342g，KH2PO40.06g，三蒸水1000ml，调PH值至7.4，0.22μm微孔滤膜抽滤除菌，置4℃保存备用。(3)含10％或20％胎牛血清（FBS）的细胞培养液:用低糖的DMEM液体培养基按9:1或4:1的体积比与胎牛血清混匀，即得到含10％或20％FBS的细胞培养液，分装，4℃保存。(
5、4)0.25％胰蛋白酶：称取所需量的胰蛋白酶粉末，加PBS液溶解，调节PH7.2，无菌过滤，分装，-20℃冷冻保存。(5)分离血管平滑肌细胞所用的手术工具:解剖器械（两把普通手术剪，两把止血钳，两把眼科直剪，一把眼科弯剪和三把弯头眼科镊），长吸管数根，两套平皿，一把自制细胞刮刀，121℃,20min高压灭菌，烘箱干燥备用。PBS液、D-Hanks缓冲液、胰酶、培养液临用时均用37℃预热。大鼠断头死处后,在无菌环境下,迅速分离出胸主动脉置于玻璃平皿内的D-Hanks缓冲液中，去除管腔内血液，剥离外膜及附着组织，将动脉段纵向剪开，使内膜朝上平摊于平皿上，用自制细
6、胞刮刀轻轻刮去内皮细胞，然后将中膜平滑肌剪切成若干块面积约为2mm2组织小块，均匀贴在培养皿上，置于37℃、5%CO2培养箱中，2小时后加入培养液，加入量以刚没过组织块为宜。培养液为含20%胎牛血清的DMEM培养基，2-3天换液一次，每次换液为半量换液。待细胞生长至亚融合状态时，用0.25％胰蛋白酶消化，转入25cm2培养瓶，用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行传代培养。倒置相差显微镜下观察单个平滑肌细胞呈梭形或带状,有多个细胞突起,胞浆丰富,胞质密度高,不透明,核卵圆形居中,有多个核仁。细胞生长致密时平行排列成束,部分重叠,表现为典型的“谷峰状”生长。本
7、实验所用的VSMC为传代至8～9代的细胞。2.2细胞计数台盼蓝（TrypanBlue）是一种常被使用于细胞染色的染剂。TrypanBlue无法穿透活细胞的细胞膜，但是当细胞受伤或死亡，细胞膜破损时，TrypanBlue则可以通透细胞膜进入细胞內，使细胞染成蓝黑色。利用此一特点，配合血球计数板的使用，则可以在显微镜底下，分辨出细胞样本中的活细胞与死细胞，以方便细胞计数。乙醇清洁细胞计数板（countingchamber）及专用盖玻片，用绸布擦干,待其干燥后，用移液枪轻吸细胞悬液（一般为20μl），与0.4％TrypanBlue等量充分混合后，在计数板上盖玻片的
8、一侧加微量细胞悬液.加液要溢满countingcha
