不同时间脾切除联用环孢素对协调性异种心脏移植物存活的影响论文

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1、不同时间脾切除联用环孢素对协调性异种心脏移植物存活的影响论文王博，吕毅，张晓刚，李晖，仵正，潘承恩【摘要】目的探讨脾切除联用环孢素对协调性异种移植心脏存活时间的影响及其机制。方法建立协调性异种心脏移植模型。分别采用不同时间脾切除联用环孢素，观察异种移植物的生存时间。用CH50法检测各组动物血清中总补体活性。应用流式细胞技术检测动物血清中异种反应性抗体IgG、IgM的滴度变化。移植物标本HE染色观察病理学改变。免疫组化染色观察各实验组不同时间移植物组织中IgG、IgM抗体的沉积。结果脾切除联用环孢素能够显著延长移植物的生

2、存时间(P0.05)，降低受者体内异种反应性抗体的滴度。结论脾切除联用环孢素可以减少移植术后早期受者体内异种反应性抗体的产生.freelg/kg；脾切除组(n＝10)，移植心脏复跳后即予以脾切除；D0脾切除＋CsA组(n＝15)，移植心脏复跳后即予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg；D1脾切除＋CsA组(n＝15)，移植术后1d予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg；D3脾切除＋CsA组(n=10)，移植术后3d予以脾切除，每日腹腔注射环孢素10mg/kg。1.2术后处理与观察每组随机选取5例实验动物观察

3、移植心脏存活时间。移植心脏复跳至停跳的时间为异种移植物存活时间2。移植心脏存活时间大于30d认为长期存活。移植物在3d内停跳，视为手术失败。1.3血清标本与组织标本的采集分别于移植术后1、2、3、7、14、30d剖杀动物取血清、移植心脏标本，将血清标本保存在-20℃低温冰箱中，以备检测血清中补体活性和异种反应性抗体IgG、IgM的滴度。取供体心脏组织进行HE染色的组织病理学检测。1.4CH50实验检测各实验组血清补体溶血活性配制2%(体积分数)绵羊红细胞悬液。各实验组血清、正常大鼠血清(对照)稀释20倍。用生理盐水将溶

4、血素稀释为2u/mL。在各管中分别加入试剂和反应物，放入37℃水浴箱中温浴30min。选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上，540nm波长条件下，测量读取吸光度A值。每毫升血清总补体活性(单位)＝1/血清用量×稀释倍数。1.5异种反应性抗体IgG、IgM的测定应用流式细胞技术测定对照组、D1脾切除＋CsA组、D3脾切除＋CsA组大鼠血清中异种反应性IgG、IgM抗体3。采用CellQuest软件分析系统进行数据处理。实验动物血清中所含异种反应性IgG、IgM抗体相对滴度应用下列公式表示：异种反应性IgG、IgM

5、抗体相对滴度＝各实验组血清平均荧光强度/正常大鼠血清平均荧光强度。1.6免疫组化染色检测各实验组移植物组织中异种反应性抗体IgM、IgG的沉积石蜡切片脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2室温下孵育20min。微波抗原修复，10%(体积分数)山羊血清封闭。滴加一抗，抗体稀释度为1∶50，置冰箱4℃过夜。加聚合物增强剂50-100μL，在37℃反应20min后，每张切片滴加DAB显色液。移植物组织中IgG、IgM沉积时阳性表达的判定：移植物血管内皮细胞表面和组织中可见棕黄色颗粒样物质沉积。1.7统计学处理实验数据以均数±标准

6、差(±s)表示，SPSS10.0软件包进行数据分析，P0.05为具有统计学意义。2结果2.1移植心脏存活时间脾切除组、D0脾切除＋CsA组、D1脾切除＋CsA组、D3脾切除＋CsA组移植物存活时间明显较对照组延长。环孢素组移植物生存时间与对照组无显著性差异。各实验组移植心脏存活时间见表1。表1不同组异种移植物的存活时间（略）2.2移植物的病理学改变对照组、环孢素组、脾切除组、D3脾切除+CsA组移植心脏发生排斥反应时，光镜下可见广泛血管内血栓形成伴心肌组织间大量的出血。心肌组织中大量的单个核细胞、淋巴细胞浸润(图1A)

7、。D0脾切除+CsA组、D1脾切除+CsA组移植术后第14天时，心脏组织中可见炎细胞浸润，无明显出血、血栓形成。移植术后第30天时，可见少量微血栓形成，未见明显组织出血，组织间有少量单个核细胞和淋巴细胞浸润(图1B)。2.3各组不同时间CH50值的变化正常SD大鼠血清总补体活性为(86.6±11.5)u/mL(正常参考值范围为50-100u/mL)。本实验中，对照组、环孢素组、脾切除组、D3脾切除+CsA组受体体内总补体活性在术后明显下降，提示受者体内大量补体活化。D0脾切除+CsA组和D1脾切除+CsA组受体血清CH

8、50值在移植术后处于正常范围内。2.4异种反应性抗体IgG、IgM在移植心脏组织中的沉积对照组、环孢素组、脾切除组、D3脾切除+CsA组，移植心脏发生排斥反应时，组织中可见大量IgG、IgM沉积于血管内皮细胞表面(图1C-D)。D0脾切除＋CsA组和D1脾切除+CsA组长期存活(生存时间大于30d)的移植心脏血管内皮细胞表面可见异