重组乙型肝炎病毒p22e基因在hepg2细胞中的表达

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1、重组乙型肝炎病毒P22e基因在HepG2细胞中的表达作者：刁志宏，张明霞，朱幼芙，何海棠，王战会，陈金军，侯金林【关键词】肝炎病毒,乙型；基因重组；真核表达　　ConstructionofrebinantvectorofHBVP22egeneanditsexpressioninHepG2cells　　　【Abstract】AIM:ToconstructtherebinantexpressionvectorofpCDNA3.1+HBVP22eandtransfectHepG2cellsfortheexpressionofHBVP22e,andtoa

2、ssessitsrelationstoHB.METHODS：HBVP22ecDNAplasmidp3.8ⅡebyPCRandinsertedintouniversalvectorpMD18TforidentificationofitsDNAsequence.Therebinantplasmids.HBVP22eprotEinmunohistochemistryandmicroparticleenzymeimmunoassay.RESULTS：ExpressionvectorsofrebinantpCDNA3.1+HBVP22eerC1:1873~

3、18915′GGAATTCATGTCCAAGCTGTGCCTTGGGT3′，插入EcoRI酶切位点；PcrimerC2:2454~24345′GCTCTAGACTAACATTGAGATTCCCGA3′，插入XbalI酶切位点.引物合成及克隆产品测序由大连宝生物有限公司公司完成.主要试剂和工具酶，克隆用限制性内切酶EcoRI，XbalI，T4DNALigase，胶回收纯化、质粒抽提纯化等试剂均购自大连宝生物有限公司；脂质体转染试剂为LipofectamineTM2000，InvitrogenTMlife公司产品；细胞培养用DMEM培养基与胎牛血清（

4、FCS）为PAA产品；G418为Gbico公司产品；检测HBeAg为Abbott公司微粒子免疫荧光法AxSYM专用试剂盒；HBeMonoclonalAntibody(Mouse)为ViroStat公司产品；免疫组化试剂盒为鼎国公司产品.　　1.2方法以含1.2copiesHBV基因（adr亚型）p3.8II质粒为模板，以PrimerC1，PrimerC2为一对引物按常规方法进行PCR，反应条件为:94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环，扩增结束后72℃延伸5min，电泳观察结果.PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳回收

5、纯化后，按pMD18T试剂盒说明要求，16℃，pMD18T与HBVP22ecDNA进行连接反应1h以上，CaCl2法转化E.coliDH5α菌株，经氨苄青霉素抗性及α筛选阳性克隆，经EcoRI，XbalI双酶切鉴定后送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定.测序结果用D18THBVP22e质粒，EcoRI，XbalI双酶切后回收短片段，同时用相同的限制性内切酶切割载体pCDNA3.1+并回收长片段；T4DNAligation连接靶基因及pCDNA3.1+载体片段，CaCl2法转化E.coliDH5α菌株，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，挑取20个克

6、隆，PCR法及限制性内切酶分析鉴定，阳性克隆再送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定.测序结果用EM培养基及加双抗（完全DMEM培养基）在37℃50mL/LCO2条件下培养.按常规方法获得pCDNA3.1+HBVP22e质粒后，采用脂质体介导基因转染的方法，按说明书要求：于50μL无血清DMEM细胞培养液中加入0.8μg质粒，另50μL无血清DMEM细胞培养液中加入2.0μL脂质体，轻轻混匀，室温放置15min，加入到6孔培养板中用DMEM培养液洗过两次的单层HepG2细胞上，在37℃50mL/LCO2条件下培养8h后，换用完全DMEM培养基37

7、℃50mL/LCO2培养，48h后改用终浓度400mg/LG418的完全DMEM培筛选阳性细胞，阳性克隆再扩增培养以G418以300mg/L维持，按常规进行传代培养；并设空载体pCDNA3.1+转染作为对照.取培养上清用Abbott公司微粒子免疫荧光法(microparticleenzymEImmunoassay,MEIA)上AxSYM检测HBeAg示HBVP22e的表达.阳性克隆采用免疫组化观察细胞内HBVP22e的表达，免疫细胞组织化学SP法操作过程依说明书进行.　　2结果　　经PCR获得HBVP22ecDNA，重组T载体pMD18THBVP

8、22e及其经EcoRI，XbalI双酶切15g/L琼脂糖电泳结果见图1.pMD18THBVP22e测序结果，其插入序列经用检测HBeAg