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时间:2018-11-12
《重组乙型肝炎病毒p22e基因在hepg2细胞中的表达 》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、重组乙型肝炎病毒P22e基因在HepG2细胞中的表达刁志宏,张明霞,朱幼芙,何海棠,王战会,陈金军,侯金林【关键词】肝炎病毒,乙型;基因重组;真核表达 ConstructionofrebinantvectorofHBVP22egeneanditsexpressioninHepG2cells 【Abstract】AIM:ToconstructtherebinantexpressionvectorofpCDNA3.1+HBVP22eandtransfectHepG2cellsfortheexpressionofHBVP22e,andtoassessitsrelat
2、ionstoHB.METHODS:HBVP22ecDNAplasmidp3.8ⅡebyPCRandinsertedintouniversalvectorpMD18TforidentificationofitsDNAsequence.Therebinantplasmids.HBVP22eproteinmunohistochemistryandmicroparticleenzymeimmunoassay.RESULTS:ExpressionvectorsofrebinantpCDNA3.1+HBVP22eerC1:1873~18915'GGAATTCATGTCCAAGC
3、TGTGCCTTGGGT3',插入EcoRI酶切位点;PcrimerC2:2454~24345'GCTCTAGACTAACATTGAGATTCCCGA3',插入XbalI酶切位点.引物合成及克隆产品测序由大连宝生物有限公司公司完成.主要试剂和工具酶,克隆用限制性内切酶EcoRI,XbalI,T4DNALigase,胶回收纯化、质粒抽提纯化等试剂均购自大连宝生物有限公司;脂质体转染试剂为LipofectamineTM2000,InvitrogenTMlife公司产品;细胞培养用DMEM培养基与胎牛血清(FCS)为PAA产品;G418为Gbico公司产品;检测HBeAg
4、为Abbott公司微粒子免疫荧光法AxSYM专用试剂盒;HBeMonoclonalAntibody(Mouse)为ViroStat公司产品;免疫组化试剂盒为鼎国公司产品. 1.2方法以含1.2copiesHBV基因(adr亚型)p3.8II质粒为模板,以PrimerC1,PrimerC2为一对引物按常规方法进行PCR,反应条件为:94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,共35个循环,扩增结束后72℃延伸5min,电泳观察结果.PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化后,按pMD18T试剂盒说明要求,16℃,pMD18T与HBVP22ecDNA进行
5、连接反应1h以上,CaCl2法转化E.coliDH5α菌株,经氨苄青霉素抗性及α筛选阳性克隆,经EcoRI,XbalI双酶切鉴定后送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定.测序结果用D18THBVP22e质粒,EcoRI,XbalI双酶切后回收短片段,同时用相同的限制性内切酶切割载体pCDNA3.1+并回收长片段;T4DNAligation连接靶基因及pCDNA3.1+载体片段,CaCl2法转化E.coliDH5α菌株,涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,挑取20个克隆,PCR法及限制性内切酶分析鉴定,阳性克隆再送大连宝生物有限公司进行DNA序列测定.测序结果用EM培养基
6、及加双抗(完全DMEM培养基)在37℃50mL/LCO2条件下培养.按常规方法获得pCDNA3.1+HBVP22e质粒后,采用脂质体介导基因转染的方法,按说明书要求:于50μL无血清DMEM细胞培养液中加入0.8μg质粒,另50μL无血清DMEM细胞培养液中加入2.0μL脂质体,轻轻混匀,室温放置15min,加入到6孔培养板中用DMEM培养液洗过两次的单层HepG2细胞上,在37℃50mL/LCO2条件下培养8h后,换用完全DMEM培养基37℃50mL/LCO2培养,48h后改用终浓度400mg/LG418的完全DMEM培筛选阳性细胞,阳性克隆再扩增培养以G418以
7、300mg/L维持,按常规进行传代培养;并设空载体pCDNA3.1+转染作为对照.取培养上清用Abbott公司微粒子免疫荧光法(microparticleenzymeimmunoassay,MEIA)上AxSYM检测HBeAg示HBVP22e的表达.阳性克隆采用免疫组化观察细胞内HBVP22e的表达,免疫细胞组织化学SP法操作过程依说明书进行. 2结果 经PCR获得HBVP22ecDNA,重组T载体pMD18THBVP22e及其经EcoRI,XbalI双酶切15g/L琼脂糖电泳结果见图1.pMD18THBVP22e测序结果,其插入序列经用检测HBeAg示HB
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