5种大黄蒽醌类衍生物的同时测定及应用

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1、5种大黄蒽醌类衍生物的同时测定及应用作者：吕慧英，赵晨曦，梁逸曾，吴海【摘要】　　目的建立同时测定大黄药材中5种蒽醌类衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的方法，优化大黄蒽醌的超声提取工艺。方法采用反相高效液相法，色谱柱：ethodsRP-HPLConaaxim.exBalf或药用大黄RheumofficinaleBaill的干燥根和根茎，味苦、性寒。临床研究证实，大黄具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤和抗炎、泻下作用及抗菌性、止血性等多种生物学活性［1］。其主要有效成分为蒽醌类衍生物,包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚以及

2、与葡萄糖结合成苷。5种蒽醌是大黄以及衍生中药大黄属［2］质量控制的基础。　　大黄中蒽醌的分离和测定方法有薄层色谱法(TLC)［3］，高速逆流色谱法(HSCCC)［4，5］，胶束电动毛细管色谱法(MEKC)［6］，毛细管区带电泳法(CZE)［7］，高效液相色谱法(HPLC)［8］，加压毛细管电色谱(pCEC)［9］。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最普遍和常用的分析方法。本文建立了同时测定大黄药材中5种蒽醌衍生物（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚）含量的RP-HPLC法，旨在确定大黄蒽醌的最佳超声提取工艺，同时可应用于大

3、黄药材及其制剂质量的定量评价，为大黄药材的有效开发和利用提供依据。　　1仪器与材料　　Agilent1100型高效液相色谱仪（四元梯度泵，DAD检测器，HPChemStation色谱工作站，美国安捷伦科技），上海BRANSONSB2200超声波发生器，D1810C型电子分析天平（上海申生科技有限公司），R-201型旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。　　芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品购自中国药品生物制品检定所；四川产大黄药材购于湖南国杏中药饮片有限责任公司，经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定

4、为正品。药材于40℃干燥、粉碎过40目筛，贮于干燥器中置暗处保存备用；甲醇、乙腈、磷酸均为江苏汉邦科技有限公司生产的色谱纯，二次蒸馏水，乙醇、醋酸乙酯、石油醚、正己烷等均为北京化工厂生产的分析纯试剂。　　2方法与结果　　2.1HPLC-DAD分析条件色谱柱为m×250mm,5μm）；柱温：25℃；进样量：20μl；流速：1.0ml/min；检测波长225nm。流动相为甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液(3∶5∶2)。试样过0.45μm的微孔滤膜后进行HPLC分析。　　2.2标准溶液的配制　　2.2.1标准储备液精密称取5种对照品适量，加甲醇配制成含芦荟大黄素（

5、135μg/ml），大黄酸（105μg/ml），大黄素（90μg/ml），大黄酚（90μg/ml），大黄素甲醚(75μg/ml)的标准混合储备液。于4℃下冷藏，备用。　　2.2.2工作标准液临用前精密吸取适量加甲醇配制成每1ml分别含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚为13.5，10.5，9，9，7.5μg的工作标准液。　　2.3样品溶液制备称取0.5g大黄细粉，用15ml溶剂（正己烷、石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、80%甲醇、乙醇、70%乙醇、水）进行超声提取,抽滤，滤液于40℃下真空旋转蒸发至干，后用甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，于

6、4℃下冷藏，备用。　　2.4方法学实验　　2.4.1色谱分离在拟定的色谱条件下，得到芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的标准色谱图(图1a)以及大黄药材样品的色谱图(图1b)。由图1可知，样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚与相邻组分的分离度Rs>1.5,达到基线分离。　　2.4.2线性关系取混合标准储备液适量，用甲醇稀释成一系列不同浓度的标准溶液，分别进样3次，以标准溶液浓度X对峰面积Y进行线性回归，各组分在各自浓度范围内线性关系良好。结果见表1。表15种标准品线性范围，线性方程和回归系数（略）　　2.4.3精密度考察精

7、密度分为日内精密度和日间精密度。对同一工作标准液在日内连续进样5次，得日内精密度，结果测得峰面积的RSD为芦荟大黄素0.65%，大黄酸1.09%，大黄素0.98%，大黄酚1.39%，大黄素甲醚1.71%；在连续3d内分别测定5次得日间精密度，结果测得峰面积的RSD为芦荟大黄素3.46%，大黄酸2.52%，大黄素3.26%，大黄酚3.15%，大黄素甲醚3.06%。　　2.4.4重复性考察在上述色谱条件下，对同一批样品按样品溶液的制备方法平行制备6份，分别进样20μl，进样测定，按外标法测定含量并计算RSD，芦荟大黄素2.52%，大黄酸2.20%，大黄素2.1

8、0%，大黄酚2.07%，大黄素甲醚2.89%。　　2.4.5准确性