皮质骨i型胶原的提取及胶原

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1、皮质骨I型胶原的提取及胶原【摘要】探索一种较理想的皮质骨I型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料。［方法］以牛皮质骨为原料，经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉。通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉，经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原，SDSPAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征；再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料，扫描电镜观察其内部结构。［结果］所得胶原经SDSPAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合I型胶原特征；制备的支架材料外观呈圆柱状，内部为孔径均匀平行排列的微管结构，具有仿生效果。［结论］

2、皮质骨中能够获得纯度较高的I型胶原，可用于胶原材料的制作。.L.编辑。【关键词】组织工程胶原提取神经支架Abstract：［Objective］TodevelopanidealmethodforextractingtypeIcollagenfromcorticalboneandtoprepareacollagengelatinscaffold.［Method］Thecorticalboneatrixpoilland:methanol(1:1,v/v).Theosscinsprovedpepsindigestionmethodaftert

3、hebonematrixpoinoacidpositionanalysis.ThebiomaterialadeoftypeIcollagenandgelatinusingfreezedryingmethod,andthealignmentregularitiesofmicroscopicchannelsandthEircoursedirectionsicroscope.Thesizeofthemicroporesandthefactorofporosityeasured.［Result］Thecollagenextractededto

4、betypeIcollagenbySDSPAGEandaminoacidpositionanalysis.Allthescaffoldslookedlikecircularcylinder,themicroscopicchannelsanners,andtheporesizesofthechannels.［Conclusion］OssEInextractedfromcorticalboneisarealtypeIcollagenthatcanbeappliedintheconstructionofcollagenproducts.Ke

5、ym骨粉，持续搅拌下加入甲醇：氯仿(1∶1，v／v)脱脂48h，每24h换脱脂液1次;0.6mol／L盐酸脱钙84h，分别于第12、36、60h换脱钙液，脱钙结束后去离子水洗涤3次备用。1.2胶原的提取将50g牛皮质骨基质粉浸在500ml0.05mol／L冰醋酸和500mg胃蛋白酶混合溶液中，持续搅拌96h。待混合物变为无色、透明、粘稠液体后高速低温离心20min(10000r／min)，以去除未溶解杂质。其上清即为液态粗制胶原。在上清中缓慢加入NaCl，搅拌过夜，离心20min(15000r／min)，去上清，沉淀物加入0.5mol／L

6、冰醋酸溶解，离心20min(15000r／min)，取上清加入5mol／LNaOH调pH至7.3，缓慢加入NaCl，搅拌过夜，离心20min(15000r/min)，去上清，沉淀物加入0.5mol／L醋酸中透析溶解，离心10min(15000r/min)，去沉淀，上清装入透析袋中持续透析72h，每4h更换透析液1次。最终收获无色透明粘性液体，浓缩冻干。以上液体及操作在4～7℃进行。1.3支架材料的制备称取样品150mg、明胶(Sigma公司)75mg溶于0.05mol／L冰醋酸溶液，4℃条件下搅拌90min(18000r／min)，负压抽

7、真空后于4℃冰箱中过夜，充分混合成凝胶状悬浊液后将其注入长10cm、内径3mm的硅胶管中，密封两端，顺轴向以自制微型调速仪以2×10-5m／s的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40℃、100mTorr条件中冻干48h，制得干燥成形的胶原蛋白支架材料［2］。材料用戊二醛交联，60Co消毒密封备用［3］。1.4胶原的鉴定1.4.1取样品2μg溶于420　μl加样缓冲液(1mol／LTrisHCl缓冲液，10％SDS，2％巯基乙醇，50％甘油，微量溴酚蓝)过夜，100℃，5min，离心10min(12000r/m

8、in)，取上清20μl加样，进行SDSPAGE垂直平板电泳，浓缩胶5％，分离胶8％，电极缓冲液SDSTris甘氨酸系统，浓缩胶电压40V，分离胶电压80V，0.25％考马斯亮蓝R250