铝暴露对大鼠海马蛋白激酶cγ亚型影响

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1、铝暴露对大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型影响【摘要】目的通过研究慢性铝暴露大鼠海马蛋白激酶Cγ亚型（PKCγ)的蛋白和mRNA表达的变化，观察大鼠海马CA1区长时程增强（LTP)形成，探讨铝暴露对学习记忆机制的影响。方法选择断乳后AN公司）；鱼精蛋白、兔抗鼠PKCγ抗体和显色试剂盒(美国Sigma公司）；PKCγ引物（北京奥科生物技术有限责任公司）；RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗（北京中衫生物公司）；［γ-32P］-ATP（北京福瑞公司）；其他试剂均为分析纯。　　12染铝动物模型选

2、择断乳后iImager5500V2103图像分析软件对实验结果进行分析，灰度值代表蛋白含量，以对照组蛋白含量为100，铝中毒组与其对比。　　16用RT-PCR检测PKCγ的mRNA表达情况（1)总RNA提取：取大鼠海马50～100mg，按V-gene试剂盒说明书操作提取。(2)cDNA合成：按TakaraRT-PCR试剂盒说明书进行逆转录反应，总反应体积20μl。(3)PCR反应：应用PrimerPremier50软件设计引物，PKCγ的上游引物为：5′-ACCAAGCACCCAGGAAAAC-3′PKCγ的下

3、游引物为：5′-GATGCTGGCTAGAACCAAGC-3′。PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s,515℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环，72℃延伸10min。β-actin的上游引物为5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'β-actin的下游引物为：5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，产物长度为701bp。PCR反应条件同上。(4)PCR产物的分析：取PCR扩增后的产物51μl进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，利用凝胶自动分析成像软件ChemIma

4、ge5500进行灰度值分析，利用β-actin灰度值为内对照，求出PKCγmRNA量的相对值。　　17统计分析采用SPSS100软件进行单因素方差分析。　　2结果　　21血铝和脑铝的浓度（表1)随铝浓度的增加，血铝和脑铝的浓度随之增加。染铝组与对照组比较,差异有统计学意义（P<005)；02%与04%组比较,差异有统计学意义（P<001)；04%与06%组比较，差异无统计学意义（P>005)。　　表1各组大鼠血铝和脑铝的比较（略）　　注：与对照组比较，aP<001;与0

5、2%比较，bP<001　　22LTP的测定结果染铝组大部分大鼠海马齿状回LTP增强幅度与对照组比较均有下降。染铝各组高频刺激后LTP增加的群体峰电位（PS）幅值比率（02%组，04%组，06％组）与对照组相比均明显降低，随着染铝剂量的增加，LTP增加的PS幅值比率逐渐下降；在对照组中高频刺激后PS幅值稳定且增长平均在150％左右，符合正常的生理现象，而染铝组高频刺激后PS幅值基本与初始相同，在45min以后其PS幅值仍然没有上升到正常的生理范围，表明染铝抑制了大鼠LTP的发生和维持；此外在染铝组均出现

6、了有长时程抑制（LTD)的现象，而对照组却未有一例出现。　　23胞浆和胞膜的PKC活性结果（表2）各染铝组细胞膜PKC活性与对照比较，差异有统计学意义（P<001)，但染毒组间差异无统计学意义（P>005)。各染铝组细胞浆PKC活性与对照比较，差异无统计学意义（P>005)，染铝组间差异无统计学意义（P>005)。细胞膜PKC活性高于细胞浆PKC的活性。　　表2各组大鼠胞膜和胞浆PKC活性的比较（略）　　注：与对照组比较，aP<001　　24PKCγ蛋白表达的结果（图1）各

7、染铝组PKCγ的非磷酸化蛋白表达与对照组灰度值的比较，差异有统计学意义（P<005)；染铝组间灰度值的比较，02％与06％组，P<005;02％与04％组；04％与06％差异无统计学意义（P>005)。　　25PKCγmRNA表达的结果（图2）各染铝组PKCγ的mRNA表达与对照组灰度值比较，差异有统计学意义(P<005);02％与04%,06％组间灰度值的比较，差异有统计学意义（P<005);04％与06％组比较，差异无统计学意义（P>005)

8、。　　图1不同浓度铝中毒大鼠海马PKCγ的非磷酸化蛋白表达（略）　　图2不同浓度铝中毒大鼠海马PKCγ的mRNA表达（略）　　3讨论　　近年来研究证明〔7〕，PKC与突触可塑性及LTP的形成密切相关，PKC的激活是LTP产生的重要条件。现有理论认为，诱导LTP的高频刺激促进了突触前膜谷氨酸递质的大量释放，使突触后膜去极化叠加而达到一定程度，从而