川芎多糖除蛋白方法研究

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1、川芎多糖除蛋白方法研究作者：方升平，王维香，雒小龙【摘要】目的对川芎多糖进行除蛋白处理，筛选最佳除蛋白方法。方法采用Sevag法、三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法3种方法对川芎多糖进行除蛋白处理，通过比较不同方法处理后的蛋白含量及多糖含量来确定最佳的除蛋白方法。结果Sevag法的蛋白质去除率高(90%以上)，但多糖回收率仅为40%;三氯乙酸法的蛋白质去除率为37.28%，多糖回收率为73.19%;三氯乙酸-正丁醇法的蛋白质去除率为83.60%，多糖回收率为85.16%，且操作快速、简便。结论三氯乙酸-正丁醇法除蛋白效果较好。【关键词】川芎;多糖;除蛋白川芎为《中国药典》2005年

2、版(I部)收载品种，为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛的功效，常用于治疗月经不调，经闭痛经，症瘕腹痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，头痛，风湿痹痛[1]。川芎含有内酯类、生物碱类、酚类、以及挥发油类等多种化合物，对其多糖的研究也逐步受到重视[2,3]。鉴于多糖是构成生命的基本物质之一，具有多种生理活性[4]，对川芎多糖的研究就显得尤为必要。系统研究川芎中多糖物质，阐明其生物活性，为开发高技术含量的川芎多糖保健食品和药物提供理论基础。其中，川芎多糖分离纯化是首要和关键的步骤，多糖纯度的高低直接影响后续的性质、结构分析、药理活

3、性以及构效关系研究的准确性。在多糖提取液中[5～7]，蛋白质却占了很大的比例，因此，如何尽量多去除蛋白质而保留多糖的有效成分是一个具有重要意义的课题。多糖中蛋白质的去除方法有多种，包括Sevage法[8]、三氯乙酸法[8]、蛋白酶法[9]、盐酸法[8]等。不同的方法适用不同来源的多糖，要具体摸索，实验中常采用几种方法联合除蛋白。目前尚未见到去除川芎多糖中蛋白质的研究报道，本实验对川芎多糖粗提液中蛋白质的去除方法进行了初步探讨。1材料与仪器川芎购于成都中药材市场，经本学院制药工程系唐灿博士鉴定为伞形科多年生草本植物川芎LigusticumChuanxiongHort.的干燥根茎，

4、干燥粉碎，过40目筛，待用;葡萄糖、硫酸、蒽酮、三氯乙酸、正丁醇(均为分析纯，成都金山化学试剂有限公司)。UV-2600型紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，HH-S数显恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)，RE-52B旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，电子天平BS200S(北京塞多利天平有限公司)。2方法2.1样品制备称取适量粉碎过筛的川芎粉末，经石油醚索氏抽提脱脂后风干，加入10倍蒸馏水，搅匀，100℃提取2h，离心取上清液，滤渣则以同样条件重复提取2次，合并3次提取液，旋转蒸发浓缩至1∶10(1g川芎粉末∶10ml提取液)。2.2多糖测定方法采用蒽酮-硫酸法[5]工作

5、曲线方程为：Y=0.1652X-0.001(R2=0.9994)。Y：葡萄糖浓度(mg/ml);X：吸光度。2.3蛋白质含量测定紫外吸收直接测定法[10]在紫外分光光度计上，以生理盐水为对照，测得待测溶液在280nm和260nm两种波长的吸光度(A280nm及A260nm)。将A280nm和A260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质的浓度。C=1.45A280nm-0.74A260nm式中C：蛋白质浓度(mg/ml);A280nm：溶液在280nm处测得的吸光度;A260nm：溶液在260nm处测得的吸光度。2.4除蛋白方法2.4.1Sevag法取25ml浓缩糖液，将氯

6、仿按浓缩液1/5体积加入，随之再加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合物剧烈振荡30min，分出水层和有机层交界处的变性蛋白质。重复上述操作，直至无变性蛋白质出现。测定上清液的多糖浓度和蛋白质浓度。2.4.2三氯乙酸法取25ml浓缩糖液，加入适量的2mol/L三氯乙酸溶液，混合器上振荡混合均匀后4℃下静置过夜，离心弃去沉淀，收集上清液，测定多糖浓度和蛋白质浓度。2.4.3三氯乙酸-正丁醇法取25ml浓缩糖液，加入适量的三氯乙酸与正丁醇的混合液于混和振荡器上混合均匀，4℃下静置一段时间，离心弃去沉淀，收集上清液，测定多糖浓度和蛋白质浓度。3结果3.1Sevag法除蛋白效果重复Sevag

7、法操作11次，无变性蛋白质出现(蛋白质去除率在90%以上)，多糖回收率仅为40%。3.2三氯乙酸法除蛋白效果3.2.1三氯乙酸溶液的用量对除蛋白效果的影响由图1可以看出，随着三氯乙酸用量的增大，除蛋白效果增强，同时多糖的损失率也逐渐增加。但三氯乙酸的体积超过多糖液体积的7%时，多糖的损失加剧，而蛋白去除率增加缓慢。故三氯乙酸溶液合理用量为多糖体积的7%，此时蛋白去除率为26.28%，多糖回收率为65.79%。图1三氯乙酸溶液的用量对多糖溶液中蛋白质及多糖含量的影响3.2.2振荡时间对除蛋白效