单纯疱疹病毒i型糖蛋白b基因疫苗的初步免疫学研究

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1、单纯疱疹病毒I型糖蛋白B基因疫苗的初步免疫学研究作者：孟祥俊苏云贺冰吴雅臻【摘要】目的利用构建成功的重组真核表达质粒pgB免疫小鼠，探讨单纯疱疹病毒I型（HSVⅠ）gB基因作为基因疫苗的可能性。方法用重组真核表达质粒pgB免疫小鼠，通过中和试验、ELISA方法检测pgB接种小鼠的免疫效果,并对免疫的小鼠进行病毒攻击。结果实验小鼠产生了对HSV1特异性的抗体（抗体滴度：ELISA法1∶273，中和试验法：1∶49），实验组中和效价显著高于载体对照组和阴性对照组（P＜0.01）；对病毒的攻击并有免疫保护作用，实验组和空白对照组比较（P＜0.01）。结论证明pgB真核表达质

2、粒，具有DNA疫苗作用，可在小鼠体内诱发保护性免疫反应，pgB有可能作为基因疫苗用于单纯疱疹病毒性角膜炎预防和治疗，为进一步构建单纯疱疹病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎奠定了理论基础。【关键词】单纯疱疹病毒性角膜炎；糖蛋白B；基因疫苗单纯疱疹病毒性角膜炎（herpessimplexkeratitis,HSK）主要是由单纯疱疹病毒I型（herpessimplexvirus1,HSV1）直接感染角膜上皮细胞引起的点状或树枝状角膜炎；在角膜基质内发生的免疫应答，引起盘状角膜炎、基质坏死性角膜炎〔1〕。HSV1可引起潜伏感染，在机体免疫力低下时，潜伏感染的HSV1

3、可重新活化，引起HSK的复发，由于HSK的反复发作造成视力严重损害甚至失明。迄今对于HSV1的感染还未达到理想的治疗效果,故应寻求特异性强，效果更好的抗病毒药物或研制抗HSV1的安全疫苗来预防HSV1的感染和复发。本研究利用经鉴定构建成功的重组真核表达质粒pgB〔2〕作为疫苗免疫小鼠，证明了pgB基因疫苗可在动物体内表达目的蛋白，诱导机体产生特异性抗体，并具有免疫保护作用，为今后进一步研制HSVDNA联合疫苗用于单纯疱疹病毒角膜炎的预防和治疗奠定了基础。1材料与方法1.1材料健康昆明种小鼠（购自吉林大学基础医学院动物实验室），雄性，体重（18±2）g，4～6周龄；

4、大肠杆菌DH5α及真核表达质粒pcDNA3（吉林大学第一医院中心研究室提供）；重组真核表达质粒pgB由本研究的前期工作制备〔2〕。1.2方法1.2.1质粒的大量提取转化有pcDNA3和pgB的大肠杆菌液严格按照无内毒素型质粒DNA大量纯化试剂盒（Vitagene）的说明书进行提取；将最终得到的质粒在紫外分光光度仪下测OD260/OD280和OD260。1.2.2质粒的内毒素检测提纯的质粒pcDNA3和pgB定量分析后，鲎试剂检测有无凝集反应。1.2.3免疫小鼠〔3〕本实验选取肌肉接种的方法，把昆明种小鼠随机分为实验组、载体对照组、空白对照组，每组10只。将小鼠双后肢用75

5、0ml/L酒精消毒，双侧股四头肌多点注射。每组的PBS液与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1（V∶V）混合（简称混合液），直至全部乳化。实验组：注射含pgB的混合液，每侧200μl（含pgB50μg）；载体对照组：注射含pcDNA3的混合液，每侧200μl（含pcDNA350μg）；空白对照组：只注射混合液，每侧200μl；间隔2in后,1000r/min离心10min，吸取血清，-20℃保存用于检测。1.2.4中和试验参照影响基因疫苗效果的主要因素：①最重要的是保护性抗原基因的选择：应选择病原体的主要保护性抗原基因，本研究所选用的是HSV1gB去除N端部分信号肽序列（39

6、bp）的基因片断（2673bp）。HSV1gB由UL27基因编码，全长2712bp，编码904氨基酸，由30氨基酸序列（90bp）组成的信号肽、696氨基酸序列组成的在氨基端具有亲水性的胞外区、69氨基酸序列组成的具有疏水性的跨膜区、109氨基酸序列组成的羧基端具有极性胞内区，去除部分信号肽序列不影响gB糖蛋白的分泌表达〔8，9〕。HSV1gB在疱疹病毒家族中是高度保守蛋白，各毒株间差异较小，与所有的疱疹类病毒亚群有较大的同源性，且与HSV2病毒感染具有交叉保护作用，是病毒复制必须的多功能蛋白，也是宿主免疫反应的主要靶抗原，能诱导细胞免疫、体液免疫和细胞毒T

7、淋巴细胞反应〔10，11〕。②DNA疫苗的纯度、免疫接种剂量和次数〔12〕：免疫小鼠所提取的质粒pcDNA3及pgB，经检测OD260/OD280分别为1.8056及1.9235，纯度均符合要求。内毒素是菌体细胞壁的组成成分，从E.coli中大量提取质粒时，尽可能去除质粒中的内毒素，经鲎试剂检测凝集反应阴性，这样实验结果可以真实可靠地反映该DNA疫苗的生物活性。③免疫接种途径：DNA转入机体途径有许多种，其中肌肉注射应用最早也最广泛，不同接种途径免疫效果不同，主要与机体内转染（DNA摄入和表达）的效力和转染细胞将抗原递呈给免疫