单纯疱疹病毒ⅱ型gd糖蛋白加趋化因子mip-1α核酸疫苗构建及初步免疫观察

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1、天律医利大学博十研究生学位论文AmpBSACICPEDMSODTTEBEDTAELISAFCSGHHRPHSV—I、IILBLD50LPSITTMIP一1fAMcAbMTTNS英文缩略语(按字母顺序排列)AmpicillinBovineserumaIbuminChemotacticindexCytopathiceffectDimethylsulfoxideDithiothreitoiEthidiumbromideEtllylenediaminetetraaceticacidEnzymelinkedimmunosorbentassayFetalcalf

2、serumGenitalherpesHorseradishperoxidaseHerpessimplexvirus—I、IILuriabroth50％lethaldoselipopolysaccharideLymphocytetransformationtestMacrophageinflammatoryproteinlaMonoclonalantibody5-diphenyltetrazoliumbromideNormalSa】iae氨苄青霉素牛血清白蛋白趋化指数细胞病变效应二甲基亚珊二硫苏糖醇溴化乙锭乙二胺四乙酸酶联免疫吸附试验胎牛血清生殖器疱疹

3、辣根过氧化物酶单纯疱疹病毒I、II型LB培养基半数致死量脂多糖淋巴细胞转化试验巨噬细胞炎性蛋白la单克隆抗体四甲基偶氮唑盐生理盐水天津医科大学博iti)l：宄生学位论文ODOpticaldensity光密度PBSRAW2647RT—PCRSISTDTCID50TETMBVerocellPhosphate—bufferedsalineMousemacrophagetumorcelllineReverseIcanscription—PCRStimulationindexSexuallytransmitteddisease50％tissueculturei

4、nfectivedosenis．EDTAbuffer3,3’，5，弘tetramethylbenzidineAfricangreenmonkeykidneycell2磷酸盐缓冲液小鼠巨噬细胞系逆转录聚合酶链反应刺激指数性传播疾病50％组织细胞感染量Tris—EDrlA缓冲液四甲基联苯胺烷非洲绿猴肾传代细胞天津医科大学博士研究生学位论文单纯疱疹病毒II型gD糖蛋白加趋化因子MIP．1Q核酸疫苗的构建及初步免疫观察博士研究生：邵文爱导师：李晓眠摘要单纯疱疹病毒II型(HSV-II)主要引起生殖器疱疹。近年来，生殖器疱疹的发病率在迅速上升，危害性亦曰益显得

5、突出，但目前尚无特效药控制其发生和复发，因此研制疱疹病毒疫苗已成为预防生殖器疱疹感染的关键。在现已研制的疫苗中，DNA疫苗尽管诱导的免疫应答效力较低，可因其具有制各简单、安全、诱导的免疫应答广泛长久，并且可以共表达免疫调节因子，根据需要诱导产生最适免疫应答等特性，受到人们的青睐。近几年来，国外学者们一直在探索应用分子佐剂来加强DNA疫苗的免疫效果，并取得了一定的成效。为构建有效预防HSV-II的DNA疫苗，探讨分子佐剂对DNA疫苗的作用机制，本研究完成了以下工作：1．HSV-IIgDDNA疫苗的构建：根据GenBank中HSV-IIHG52株gD基因

6、序列设计了一对引物，采用PCR方法扩增出HSV-IISav株gD全部编码区的基因片段，经中介pUCm—T载体，将其插入到真核表达质粒pcDNA3中相应的位点，并转化E．coliDH5a，构建出HSV-IIgDDNA疫苗。通过PCR、酶切和测序鉴定，证明gD基因片段在pcDNA3中插入正确，并将构建出的重组质粒命名为吨。经原位ELISA法证实，踺在COS一7细胞中瞬时表达的蛋白能够与gD单克隆抗体结台，这表职所构建的魄DNA疫苗能够在哺乳动物细胞中表达。2．小鼠趋化因子MIP一1a重组真核表达质粒的构建：首先用细菌脂多糖3天津医科大学博士研究生学位论文

7、(LPS)刺激RAW264．7细胞，提取总RNA，然后应用RT—PCR方法，扩增出MIP．1n基因的全部编码序列。经中介pUCm．T载体和HindlII、XbaI双酶切处理后，将其插入到用相同酶切的真核表达质粒peDNA3中，并转化E．coliDH5o。通过PCR、酶切和测序鉴定，证明MIP．1a基因片段在pcDNA3中插入正确，并将构建出的重组质粒命名为Pm。经RT—PCR和Boyden趋化小室法鉴定，证实了所构建的Pm在哺乳动物细胞中能够表达具有生物学活性的M碑．1a。3．Pg+PmDNA疫苗对小鼠的初步免疫观察：每次用200“g／200山pcD

8、NA3、Pg、Pg+Pm和等体积生理盐水(NS)肌肉注射免疫BALB／C小鼠，连续免疫3次，末次免疫后一个月