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1、A20在前列腺癌细胞中的表达作者：闰玮,刘家云,苏明权,李晓瑾,郝晓柯【关键词】A20;,锌指蛋白;,前列腺癌 [摘要]目的:探讨A20（肿瘤坏死因子可诱导的初级应答基因）在前列腺癌各细胞系中的表达及意义。方法:RTPCR检测体外培养的前列腺癌细胞PC3,PC3M,Du145,LNcap和22RV1中A20mRNA的表达,细胞中A20在mRNA和蛋白质表达水平均显著高于其余3种细胞系(P<001)。结论:A20在各前列腺癌细胞系中的表达不尽相同,对A20表达的研究对于下一步研究该基因在前列腺癌发生发展中的作用有重要意义。 [关键词]A20;锌指蛋白;前列
2、腺癌 A20基因最初是在人脐静脉血管上皮细胞中发现并且开始研究的,被认为是肿瘤坏死因子可诱导的初级应答基因,其基因产物为锌指蛋白A20（zincfingerprotEinA20）[1,2]。该蛋白具有抑制NFκB的活性和在一些细胞中具有抗凋亡作用的双重活性。研究发现A20在人宫颈癌HeLa细胞、肺上皮A549细胞、人肝癌HepG2细胞中不具有抗凋亡的功能,目前还不清楚为什么仅有一些细胞受到A20的保护及其保护机制[3,4]。目前对A20的研究主要集中于它在下调NFκB活性的机制及采用不同刺激因子刺激后A20表达水平的变化方面[5]。对A20在前列腺癌各细胞系中的
3、表达状况,所起的作用及作用机制还不清楚[6]。本研究中我们采用RTPCR和、LNcap、Du145和22RV1人前列腺癌细胞中A20进行检测,为下一步研究A20在前列腺癌形成及发展中的机制奠定了基础。 1材料和方法 1.1材料人前列腺癌细胞由本室保存,RPMI1640培养基为Gibco公司产品。小牛血清为杭州四季青公司产品。A20单克隆抗体（mAb）购自Calbiochem公司;羊抗小鼠的二抗,ECM显色液及βactinmAb购自武汉博士德公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;cDNA反转录试剂盒购自Promega公司,细胞裂解液为碧云天公司产品
4、。电转印仪为BIORAD公司Mini2Dcell电转印仪,DU800核酸蛋白分析仪为贝克曼公司产品。所有引物均由TaKaRa公司合成。 1.2方法 1.2.1细胞培养PC3、PC3M、DU145、LNCaP和22RV1细胞均用含100mL/L小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI1640在37℃,50mL/LCO2培养箱中常规传代培养。 1.2.2RTPCR检测mRNA提取总RNA,然后加入20μLDEPC处理的水溶解所提取的RNA,将稀释后的RNA在DU800核酸蛋白分析仪上检测,测得A260/280大于18,说明所提取的RNA质量
5、好。取2μgRNA按照Promega的逆转录试剂盒说明书,反转录出cDNA后,进行PCR。PCR的反应条件为:95℃5min,95℃40s,63℃1min,72℃15min,72℃7min共30个循环。A20的引物如下:正义链5′AGCCCTCATCGACAGAAACATCCAG3′,反义链:5′CGCTGTTTTCCTGCCATTTCTTGTA3′,扩增片断长度882bp。内参照选用βactin,引物正义链:5′GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3′,反义链:5′CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′,产物长度353bp。扩增产物15g/
6、L琼脂糖凝胶电泳,EB染色后,电泳条带经电泳图像分析扫描仪扫描,得到βactin条带,调整cDNA的用量使5个细胞系中βactin条带的浓度一致,然后进行A20基因的扩增,电泳条带经电泳图像分析扫描仪扫描,得到A20的条带。经图像分析软件分析,得到各A20条带的灰度值,峰高及密度。 1.2.3培养皿上生长超过90%底面积时,加400μL细胞裂解液提取细胞总蛋白并定量,按4∶1加入上样缓冲液,100℃煮沸5min,调整蛋白浓度至相同水平进行SDSPAGE电泳。电泳完毕后,按操作说明将胶装入电转印仪,80V电转80min后加5g/L脱脂奶粉封闭;加1∶250PBS稀
7、释的βactin、1∶1000PBS稀释的A20抗体4℃过夜;PBSTin;PBST. 2结果 2.1RTPCR结果5种前列腺癌细胞均有A20mRNA的表达,片段大小为882bp,与预计结果一致。各样本βactin对照均在相应位置353bp处出现明显的扩增条带,表明提取各细胞中RNA的质量及RTPCR过程均较良好（图1）,PC3、PC3M、Du145与22RV1之间有显著统计学差异(P<001),LNcap与22RV1之间没有统计学差异(P>005),说明A20在不同的前列腺癌细胞系中表达水平有差别,在PC3、PC3M中表达相对较高（表1）。 图
8、15种前列
